一種基于苯并噻唑的長(zhǎng)波長(zhǎng)雙響應(yīng)性熒光探針對(duì)粘度與H2O2的檢測(cè)

朱單單，瞿 鵬，孫 闖，楊 媛，劉道勝，申 琦，郝遠(yuǎn)強(qiáng)

1.遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113006 2.河南省新能源電池材料工程技術(shù)研究中心，河南省先進(jìn)電池材料開發(fā)應(yīng)用研究中心，河南生物分子識(shí)別與傳感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 商丘 476000 3.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

引 言

過(guò)氧化氫(H2O2)是一種重要的生理活性含氧分子，而且其他活性氧的產(chǎn)生與代謝過(guò)程也常需要H2O2的參與[1]。研究表明過(guò)氧化氫的非正常水平與多種疾病相關(guān)，如炎癥性疾病、心血管疾病、神經(jīng)組織退化疾病和癌癥[2-3]。另一方面，粘度作為細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要指標(biāo)參數(shù)，能反映細(xì)胞內(nèi)生物分子的信號(hào)傳導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運(yùn)輸況狀。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘度的變化和過(guò)氧化氫的非正常水平也與許多疾病有關(guān)[4]。開發(fā)一種簡(jiǎn)單可靠的方法實(shí)現(xiàn)粘度及過(guò)氧化氫的同時(shí)檢測(cè)對(duì)相關(guān)疾病的診斷及病理機(jī)制的研究有著重要的意義。

眾所周知，熒光成像分析方法具有高靈敏度、無(wú)創(chuàng)檢測(cè)、實(shí)時(shí)分析、時(shí)空分辨率高等特點(diǎn),已應(yīng)用于多種物質(zhì)的檢測(cè)[5-6]；能對(duì)多個(gè)檢測(cè)對(duì)象具有不同光譜信號(hào)通道響應(yīng)的單一分子熒光探針體系有諸多優(yōu)點(diǎn)，如分析程序簡(jiǎn)單、減少光譜串?dāng)_、避免反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)另一個(gè)探針檢測(cè)的影響[7-12]。而能夠同時(shí)檢測(cè)粘度和過(guò)氧化氫水平的熒光探針分子還鮮有報(bào)道[13]。

基于上述考慮，開發(fā)了一種基于苯并噻唑的具有長(zhǎng)波長(zhǎng)至近紅外發(fā)射特性的雙響應(yīng)性熒光探針(1)，探針對(duì)H2O2的識(shí)別基團(tuán)為苯硼酸結(jié)構(gòu)單元[14]，探針對(duì)粘度的響應(yīng)機(jī)制為隨著體系粘度的增高探針分子的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)過(guò)程逐漸被抑制，從而探針分子的熒光發(fā)射增強(qiáng)。探針(1)具有如下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)物均為長(zhǎng)波長(zhǎng)的增強(qiáng)型熒光響應(yīng)，有利于減低背景熒光的干擾，對(duì)H2O2的響應(yīng)熒光波長(zhǎng)在590 nm附近，對(duì)粘度的響應(yīng)波長(zhǎng)為680 nm；探針體系具有較大的斯托克斯位移值有利于消除激發(fā)光的干擾，對(duì)H2O2與粘度響應(yīng)的斯托克斯位移值分別為：140與230 nm；探針具有良好的生物相容性可用于細(xì)胞成像分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

2-氨基苯硫(安耐吉)，其他試劑(2-羥基-5-甲基苯甲醛，烏洛托品，4-溴甲基苯硼酸，三氟乙酸，4-甲基吡啶)均為阿達(dá)瑪斯試劑。所有的水溶液均使用Millipore的純水(18 MΩ·cm-1)配置。

CPA224S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；IKA?C-MAG HS7 電磁攪拌器(德國(guó)IKA公司)；ZF-Ⅱ型四用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；IKA?RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)；BRUKER AV400核磁共振儀(德國(guó)BRUKER公司)；Waters Acquity UPLC H-Class系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Lambda 850紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司)；LS55熒光光譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司)；ZeissLSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.2 光譜測(cè)試

1.2.1 紫外光譜

選擇DMSO-PBS體系，在配置的反應(yīng)液中探針濃度為10 μmol·L-1,DMSO所占比例為50%，溶液pH為7.4，磷酸緩沖溶液的濃度為10 mmol·L-1，選擇DMSO-PBS體積比為1∶1的溶液作為參比溶液。

1.2.2 熒光光譜測(cè)試

用DMSO溶解探針配置成母液待用，測(cè)試體系中探針濃度為10 μmol·L-1。H2O2母液用去離子水稀釋配置，通過(guò)移取不同體積的H2O2母液配置成一系列濃度梯度的待測(cè)液，在激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm下檢測(cè)其熒光發(fā)射強(qiáng)度，H2O2和粘度熒光檢測(cè)的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度分別為2.5和5 nm。探針與H2O2的反應(yīng)時(shí)間為3 h。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的A549細(xì)胞與探針(1)(10 μmol·L-1)、和依次與H2O2(100 μmol·L-1)及探針(1) (10 μmol·L-1)在37 ℃時(shí)在DMEM (Dulbecco’s modified Eagles medium)溶液中孵育。培育時(shí)間均為3 h。培育后用PBS緩沖液沖洗所培育的細(xì)胞3次以除去多余探針分子及金屬離子。細(xì)胞用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行成像(紅色通道)。

1.4 探針(1)的合成

探針(1)的合成流程如圖1所示，其中苯并噻唑4及其醛基化衍生物3的合成參見文獻(xiàn)[15]?；衔?由4-溴甲基苯硼酸與4-甲基吡啶在無(wú)水乙腈中在回流反應(yīng)得到。

圖1 探針(1)的合成路線圖Fig.1 Synthetic route for probe 1

將化合物2 (0.200 g,0.649 3 mmol)與化合物3 (0.174 6 g,0.649 0 mmol)溶于30 mL乙醇中，加入0.5 mL哌啶，80 ℃回流反應(yīng)6 h。再經(jīng)減壓蒸餾旋干溶劑，用二氯甲烷與甲醇溶解，經(jīng)柱層析純化(二氯甲烷∶甲醇=5∶1，V/V)過(guò)柱，最后得到近紅色固體粉末0.152 0 g，收率：41.87%。1H NMR (400 MHz,DMSO)δ8.66 (s,2H),8.54～8.39 (m,2H),8.13～8.03 (m,2H),7.94 (s,4H),7.82 (s,2H),7.44 (s,4H),7.23 (s,3H),5.58 (s,2H),2.22 (s,3H)。MS:m/z,理論值：[M-Br]-479.16;測(cè)量值：478.95。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針(1)對(duì)粘度及H2O2響應(yīng)的機(jī)理

探針(1)結(jié)構(gòu)中在吡啶結(jié)構(gòu)單元氮原子上連有體積較大的4-亞甲基苯硼酸基團(tuán)，從而促進(jìn)了整體分子的TICT效應(yīng)，因此探針(1)在溶液中不具有熒光發(fā)射特性。而在粘度較大的溶液中，TICT效應(yīng)能有效被抑制，且分子內(nèi)保留了從苯并噻唑單元至正離子吡啶環(huán)強(qiáng)烈的ICT效應(yīng)，因此探針(1)能呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光發(fā)射，且發(fā)射波長(zhǎng)位于較長(zhǎng)的近紅外波段處(680 nm)。在有H2O2存在條件下，H2O2能與探針(1)中的苯硼酸識(shí)別單元反應(yīng)使其氧化成酚羥基，進(jìn)一步經(jīng)1,4-消除反應(yīng)可脫除亞甲基苯硼酸基團(tuán)，得到的產(chǎn)物呈現(xiàn)出強(qiáng)的橙色熒光。基于上述不同的響應(yīng)過(guò)程，探針(1)能實(shí)現(xiàn)對(duì)粘度及H2O2的雙波長(zhǎng)通道的同時(shí)響應(yīng)(圖2)。

2.2 探針(1)對(duì)粘度熒光響應(yīng)

首先測(cè)試了探針(1)在不同比例丙三醇-DMSO體系中熒光光譜隨粘度變化的曲線。如圖3(a)所示，探針(1)在所考察的波長(zhǎng)處幾乎無(wú)熒光發(fā)射。而隨著溶液體系粘度的增高，探針在680 nm處的熒光逐漸增強(qiáng)，粘度從1.996 cp(100%DMSO)變化至851.8 cp(10%DMSO，90%丙三醇)，熒光強(qiáng)度增加了85倍。且熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)與粘度的對(duì)數(shù)在96.58～568.88 cp范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系[圖3(b)]，線性方程為log(I680)=1.2132×log(Viscosity)-1.402 3，相關(guān)系數(shù)的平方為0.997。

圖2 探針(1)對(duì)粘度及H2O2響應(yīng)的原理圖Fig.2 The response mechanisms of probe (1) for viscosity and H2O2

圖3 (a) 探針(1)(10 μmol·L-1)在不同比例丙三醇-DMSO溶液體系中(比例依箭頭方向依次為：0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)的熒光發(fā)射光譜圖；插圖為探針在低粘度及高粘度溶液中的熒光照片圖，激發(fā)光源為手持式紫外燈(365 nm)；(b) 體系熒光強(qiáng)度對(duì)數(shù)與粘度對(duì)數(shù)的線性擬合圖Fig.3 (a) Fluorescence spectra of probe (1) in DMSO-glycerol solution. Inset:the photographs of probe (1) at low (down) and high (up) viscosity under a 365 nm UV lamp;(b) The fitted curve of log(I680) versus log(Viscosity),λex=450 nm

2.3 探針(1)對(duì)H2O2響應(yīng)的紫外光譜測(cè)試

首先考察了探針(1)在磷酸緩沖溶液/DMSO混合溶劑體系(10 mmol·L-1，pH 7.4，1/1，V/V)中對(duì)H2O2的紫外光譜響應(yīng)。如圖4所示，探針(1)在375和540 nm處有吸收，溶液呈紫紅色、紅色(圖4)。隨著H2O2的加入，體系在375和540 nm處吸收逐漸減弱，在460 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，并且隨H2O2濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)H2O2濃度為200 μmol·L-1吸收峰達(dá)到最大值，反應(yīng)進(jìn)行完全，溶液變?yōu)辄S色。反應(yīng)過(guò)程中，紫外光譜的藍(lán)移可歸因于探針與H2O2反應(yīng)后，脫除了亞甲基苯硼酸基團(tuán)，N取代吡啶正離子結(jié)構(gòu)隨之消失，從而削弱了分子的ICT效應(yīng)。

圖4 探針(1)(10 μmol·L-1)在不同濃度H2O2(依箭頭方向，濃度依次為：0，20，40，60，80，100，200和300 μmol·L-1)存在條件下的紫外光譜圖；插圖為相應(yīng)探針溶液(上)及探針與H2O2 (200 μmol·L-1)混合溶液(下)的照片F(xiàn)ig.4 UV-Vis spectra of probe (1) in the presence of different concentrations of H2O2 (0,20,40,60,80,100,200 and 300 μmol·L-1),Inset:the photographs of probe (1) (up) and probe 1 with H2O2 (200 μmol·L-1) (down)

2.4 探針(1)對(duì)H2O2檢測(cè)的靈敏度與選擇性

實(shí)驗(yàn)在磷酸緩沖與DMSO的混合溶劑體系中(10 mmol·L-1，pH 7.4，1/1，V/V)考察了探針(1)的熒光響應(yīng)與H2O2濃度之間的定量關(guān)系。如圖5(a,b)，隨著H2O2濃度的增加，探針體系的熒光發(fā)射逐漸增強(qiáng)，當(dāng)過(guò)氧化氫為200 μmol·L-1時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)。且線性擬合發(fā)現(xiàn)體系在590 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度與過(guò)氧化氫濃度在0～25 μmol·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：I590=2.742×cH2O2/μmol·L-1+27.986 (R2=0.996 6)，根據(jù)3σ規(guī)則計(jì)算檢出限為0.34 μmol·L-1。

圖5 (a)探針與不同濃度的H2O2(依箭頭方向，濃度依次為：0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,150,200,250和300 μmol·L-1)反應(yīng)后的熒光圖譜;(b)對(duì)應(yīng)的探針與不同濃度的H2O2反應(yīng)后的熒光發(fā)射的強(qiáng)度，插圖為熒光強(qiáng)度與H2O2濃度的線性擬合圖Fig.5 (a) Fluorescence spectra of probe (1) in the presence of different concentrations of H2O2(from 0 to 300 μmol·L-1);(b) The correlation beween fluorescence intensity of probe (1) with the concentration of H2O2. Inset:the fitted curve of I590 versus the concentration of H2O2

圖6 探針(1)(10 μmol·L-1)與H2O2(200 μmol·L-1)及其他干擾物(200 μmol·L-1)反應(yīng)后的熒光光譜圖Fig.6 Fluorescence spectra of probe (1) (10 μmol·L-1) in the presence of H2O2 (200 μmol·L-1) and other interferences (200 μmol·L-1)

2.5 細(xì)胞成像分析

實(shí)驗(yàn)用探針(1)進(jìn)行了活細(xì)胞成像分析[見圖7(a—f)]，當(dāng)A549細(xì)胞與探針(1)培育后僅顯示出了很微弱的熒光[圖7(b)]。而A549細(xì)胞先用H2O2處理，再加入探針(1)培育，結(jié)觀察到了強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)熒光[圖7(e)]，且細(xì)胞保持了較好的存在形態(tài)。上述結(jié)果表明，探針(1)具有較好的生物相容性及細(xì)胞膜通透性，且可有效用于活細(xì)胞內(nèi)的成像分析。

圖7 探針(1)的細(xì)胞成像照片(a)，(b)，(c)為A549細(xì)胞與探針(1)培育的照片；(d)，(e)，(f)為A549細(xì)胞與H2O2培養(yǎng)后再與探針(1)培育的照片；(a)，(d)為明場(chǎng)照片；(b)，(e)為熒光成像照片；(c)，(f)分別為(a)，(b)及(d)，(e)合并的圖片；濃度標(biāo)尺為20 μmol·L-1Fig.7 Confocal fluorescence images of live A549 cells

Cells incubated with 10 μmol·L-1probe (1) (a),(b),(c),cells incubated with 100 μmol·L-1H2O2and consequently with 10 μmol·L-1probe (1) (d),(e),(f)；(a) and (d) are bright-field images；(b) and (e) are fluorescence images images in red channel；(c) and (f) are merged images；Scale bar:20 μmol·L-1

3 結(jié) 論

合成了一種具有D-π-A結(jié)構(gòu)的近紅外熒光探針，探針能實(shí)現(xiàn)對(duì)粘度及H2O2的雙重響應(yīng)。其中對(duì)粘度響應(yīng)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在680 nm處，線性范圍為96.58～568.88 cp。對(duì)H2O2的增強(qiáng)型熒光響應(yīng)波長(zhǎng)在590 nm處，線性范圍為0～25 μmol·L-1,檢出限為0.34 μmol·L-1，且對(duì)H2O2的檢測(cè)具有良好的選擇性。此外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，該探針具有良好的生物相容性與細(xì)胞膜通透性，且可有效用于細(xì)胞內(nèi)H2O2的成像分析。