急性腦梗死患者外周血Th17、Treg、Th17/Treg及炎癥因子的動(dòng)態(tài)變化過程研究

劉潔，胡小輝，龔道愷

急性腦梗死(AIS)能激活一系列炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及趨化因子等，從而加重神經(jīng)損傷，影響預(yù)后[1]。其中，輔助性 T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)是保持相對(duì)平衡的T淋巴細(xì)胞亞群；但是，Th17和Treg細(xì)胞平衡一旦打破，能加劇疾病的發(fā)展[2]。另外，IL-6、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細(xì)胞沉降率(ESR)等是臨床上常用來評(píng)估全身炎性反應(yīng)的指標(biāo)[3]。目前缺乏Th17、Treg及Th17/Treg平衡與AIS炎癥反應(yīng)關(guān)系的研究。因此，本研究旨在闡述外周血Th17、Treg及Th17/Treg平衡和炎癥因子動(dòng)態(tài)變化情況，并分析其在AIS患者中的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 納入2019年1月至2019年8月荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性動(dòng)脈粥樣硬化性AIS患者32例，其中男19例，女13例；年齡為39～81歲，平均(63.1±10.7)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT 和(或)MRI證實(shí)診斷；(2)發(fā)病48 h內(nèi)入院治療；(3)首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在腦血管動(dòng)脈瘤、心源性腦栓塞、靜脈竇血栓、動(dòng)靜脈畸形、夾層、動(dòng)脈炎及煙霧病的患者；(2)住院期間合并感染者；(3)合并急性心肌梗死、嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病、血液循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾??；(4)近期4周內(nèi)存在感染、骨折外傷、手術(shù)及服用抗炎藥物、免疫抑制劑。對(duì)照組為同期健康體檢者，共32名，其中男14名，女18名; 年齡為30～78歲，平均(59.5±11.2)歲。均排除腦血管病、心肌梗死、糖尿病、惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾病，近期4周內(nèi)無感染、骨折外傷、手術(shù)，未服用抗炎藥物及免疫抑制劑。對(duì)照組與AIS組間在性別和年齡方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究獲得知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 采血及實(shí)驗(yàn)室檢查 所有AIS患者給予常規(guī)治療。于住院后第1 d、4 d、7 d清晨，分別使用 EDTA 抗凝管采取空腹外周肘靜脈血5 ml，平均分為兩管，并在6 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg比例。抽靜脈血在3 h內(nèi)，用Sysmex XN-1000全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血常規(guī)，并計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值。采用賽科希德SD-100動(dòng)態(tài)血沉壓積測(cè)試儀測(cè)ESR，并采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)IL-6，免疫比濁法測(cè)CRP。

1.2.2 主要試劑和設(shè)備 Anti-CD127-PE-Cy7抗體、Anti-IL-17A-PE抗體、Leukocyte Activation Cocktail細(xì)胞刺激阻斷劑(含有佛波醇酯、離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑)、Cytofix/Cytoperm 破膜固定試劑盒均購自于美國BD公司。Anti-CD25-PE抗體、Anti-CD4-FITC抗體購自于美國Biolegend 公司。OptiLyse C溶血素、Epics-XL流式細(xì)胞儀均購于美國Beckman Coulter公司。

1.2.3 Th17的檢測(cè)方法 取新鮮無菌EDTA-K2抗凝全血和PRMI 1640培養(yǎng)液各200 μl混勻，加入細(xì)胞刺激阻斷劑1 μl置于37 ℃、5% CO2刺激培養(yǎng)5 h；加入Anti-CD4-FITC 5 μl，室溫避光孵育20 min；加入溶血素，室溫避光孵育10 min；加入1 ml PBS，避光靜置5 min 后，1 500 r/min 離心5 min，倒上清液；加入500 μl破膜固定劑避光20 min，離心去上清液。加入稀釋后的緩沖液Wash buffer 2 ml，室溫避光靜10 min，離心去上清液。加Wash buffer 100 μl，加Anti-IL17A-PE 20 μl，室溫避光孵育30 min。加Wash buffer 2 ml，離心去上清液后，加入0.5 ml PBS 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀，以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，對(duì) CD4+T 細(xì)胞分泌IL-17A的Th17進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Treg的檢測(cè)方法 在流式管中加入Anti-CD4-FITC、Anti-CD25-PE及Anti-CD127-PE-Cy7各5 μl；再加入EDTA-K2全血100 μl，混均，避光孵育20 min; 加入OptiLyse C溶血素0.5 ml，混勻，避光孵育10 min; 加入1 ml PBS，避光靜置5 min后，1 500 r/min 離心 5 min，倒上清液后，加入0.5 ml PBS 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀，以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，檢測(cè)CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié) T 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分率。

2 結(jié) 果

2.1 AIS組早期外周血Th17、Treg的表達(dá)及Th17/Treg比值動(dòng)態(tài)變化情況 見表1。AIS組第1 d、4 d，患者外周血Th17比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；第7 d患者外周血Th17比例減小，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.114)。外周血Treg比例在第1 d明顯低于對(duì)照組，第4 d Treg比例增高，但仍低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7 d患者外周血Treg比例繼續(xù)升高，恢復(fù)至對(duì)照組水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.507)。AIS患者外周Th17/Treg比值在第1 d、4 d、7 d逐漸減小，但均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 AIS組外周血Th17、Treg比例及Th17/Treg變化[M(IQR),n=32]組別Th17(%)Treg(%)Th17/Treg對(duì)照組4.47(3.80)3.56(1.04)1.31(1.00)AIS組 1d7.31(3.67)△2.90(1.78)△2.75(2.56)△ 4d7.69(3.05)△3.14(1.41)△2.56(1.89)△ 7d5.69(2.47)3.32(2.43)1.77(1.08)△ 注:與對(duì)照組相比△P<0.05

2.2 AIS組早期炎性指標(biāo)IL-6、NLR、CRP及ESR動(dòng)態(tài)變化情況 見表2。AIS組第1 d、4 d、7 d，IL-6逐漸減低，但均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。NLR和CRP在AIS后第1 d高于對(duì)照組，第4 d繼續(xù)增高，第7 d有所下降，整個(gè)過程持續(xù)高于對(duì)照組(均P<0.05)。ESR在AIS后第1 d，與對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.278)；第4 d明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，第7 d有所下降，但高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 AIS組Th17及Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg、NLR、CRP、ESR水平分別與IL-6的相關(guān)性分析 見圖1。AIS患者第1 d、4 d、7 d外周血Th17比例及Th17/Treg、NLR、CRP、ESR分別與IL-6呈正相關(guān)(ρ=0.298，P=0.007；ρ=0.351，P=0.001；ρ=0.377，P=0.001；ρ=0.582，P=0.000；ρ=0.388，P=0.000)；Treg比例與IL-6呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.242，P=0.029)。

表2 AIS組IL-6、NLR、CRP、ESR的變化[M(IQR),n=32]組別IL-6(ng/L)NLR CRP(mg/L)ESR(mm/h)對(duì)照組1.50(1.26) 1.68(1.33) 0.56(0.78)12.0(9.0)AIS組 1d6.76(12.43)△2.59(2.40)△2.27(5.38)△13.0(11.0) 4d5.03(9.38)△3.01(2.19)△5.04(7.02)△23.0(19.5)△ 7d4.27(3.38)△2.66(2.91)△4.63(9.01)△18.0(23.0)△ 注:與對(duì)照組相比△P<0.05

圖1 AIS患者Th17及Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg、NLR、CRP、ESR水平分別與IL-6的相關(guān)性分析；ρ為相關(guān)系數(shù)

3 討 論

AIS發(fā)生后局部炎癥可迅速激活全身性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)腦組織的二次損傷[4]。Th17是參與組織炎癥和自身免疫的主要細(xì)胞類型，Treg則介導(dǎo)免疫耐受、防止腦組織損傷，因此Th17/Treg細(xì)胞的平衡是AIS缺血性腦損傷的重要決定因素[5]。探索AIS早期外周免疫狀態(tài)，有助于了解疾病的發(fā)展過程。

Th17和Treg都起源于CD4+T淋巴細(xì)胞，不僅在功能上相互拮抗，而且在細(xì)胞分化上可以相互影響和轉(zhuǎn)化[6]。Th17分泌的細(xì)胞因子可以影響Treg分化形成，加劇腦損傷；與此同時(shí)，Treg也可以通過轉(zhuǎn)錄的特異性Foxp3抑制Th17分化和IL-17表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[7]。因此，Th17/Treg可以反映這兩類細(xì)胞外周免疫平衡狀態(tài)。已有研究表明，Th17和Treg參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，而且Th17/Treg的失衡可誘導(dǎo)斑塊破裂或內(nèi)皮侵蝕，最終導(dǎo)致血栓形成[8]。但是，目前缺乏人外周血Th17、Treg 的表達(dá)與AIS病情進(jìn)展的動(dòng)態(tài)研究。本研究結(jié)果顯示，在AIS后的第1 d，Th17顯著升高，而Treg表達(dá)受到抑制，Th17/Treg的平衡被打破，說明早期炎癥反應(yīng)以促炎反應(yīng)為主，免疫保護(hù)作用減弱。隨后，Th17逐漸減少，Treg表達(dá)逐漸增多，并在AIS第7 d基本恢復(fù)至對(duì)照組水平。表明隨著機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，Treg抗炎作用增強(qiáng)，限制Th17表達(dá)。但此時(shí)，與對(duì)照組相比，Th17/Treg紊亂仍然存在，說明在AIS后的第7 d細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)尚未完全恢復(fù)。由此可見，比起Th17和Treg，Th17/Treg能反映AIS后的免疫平衡狀態(tài)。

IL-6可以由小膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，介導(dǎo)、參與AIS的全身炎性反應(yīng)[9]。IL-6不僅能促進(jìn)初始T淋巴細(xì)胞向Th17分化，還能使擴(kuò)增的Treg轉(zhuǎn)化為效應(yīng)Th17，干預(yù)Th17/Treg的平衡調(diào)節(jié)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，AIS患者血清中IL-6的水平與Treg的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與Th17水平呈正相關(guān)。這與Li等的研究結(jié)果一致[11]。而且，本研究進(jìn)一步證實(shí)，IL-6在AIS后的第1 d表達(dá)水平最高，之后表達(dá)逐漸降低，第7 d時(shí)IL-6水平仍高于對(duì)照組，這一變化趨勢(shì)與Th17/Treg一致。而且，IL-6水平與Th17/Treg呈正相關(guān)，說明IL-6可能參與了AIS外周細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的全過程。

NLR是簡(jiǎn)單易行的新型炎性標(biāo)志物，與AIS缺血灶體積大小密切相關(guān)[12]。AIS局部的促炎介質(zhì)可迅速釋放到體循環(huán)中，中性粒細(xì)胞大量激活，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9破壞血-腦屏障，從而誘導(dǎo)周圍炎癥因子和細(xì)胞浸入腦實(shí)質(zhì)[13]。同時(shí)，交感神經(jīng)的過度反應(yīng)導(dǎo)致成熟淋巴細(xì)胞凋亡，AIS患者處于免疫抑制狀態(tài)，增加感染機(jī)會(huì)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)NLR腦卒中第1 d升高，在第4 d達(dá)到高峰，此后緩慢降低，因此推測(cè)AIS早期高水平的NLR有神經(jīng)功能損傷的風(fēng)險(xiǎn)，并且容易合并感染。IL-6能誘導(dǎo)肝臟合成CRP[15]，并與CRP水平呈正相關(guān)，但并不完全同步增長(zhǎng)，CRP表達(dá)高峰可能出現(xiàn)滯后現(xiàn)象(表2)。ESR是非特異性炎性標(biāo)志物，盡管靈敏度和特異性不高，但可以聯(lián)合其他炎癥指標(biāo)，共同評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度和AIS不良預(yù)后[16-17]。ESR、NLR及CRP三者變化趨勢(shì)基本一致，即逐漸上升再下降，并且均與IL-6的表達(dá)水平密切相關(guān)。因此推測(cè)，IL-6、NLR、CRP及ESR在AIS患者全身炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，外周Th17、Treg參與AIS發(fā)生和發(fā)展過程；IL-6不僅可作用于Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)，還能與ESR、NLR及CRP共同反映了AIS患者全身炎癥動(dòng)態(tài)變化情況。臨床上，采用多個(gè)炎癥指標(biāo)聯(lián)合更有利于 AIS的早期診斷、病情變化的判斷。