低劑量黑碳誘發(fā)人肺上皮細(xì)胞的毒性效應(yīng)及其氧化損傷

溫海燕，沈建云，姜 楠，周 萌，雷田田，邢 本，姜雙林*

（1.阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.環(huán)境激素與生殖發(fā)育安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037）

黑碳（black carbon,BC）是由生物質(zhì)或化石燃 料不完全燃燒產(chǎn)生的一種含碳的混合物，BC是大氣細(xì)顆粒物（fine particulate matter,PM2.5）的主要化學(xué)組分之一，構(gòu)成了PM2.5的碳核[1-2]。由于黑碳具有發(fā)達(dá)的孔隙、粒徑小、比表面積大等獨(dú)特的理化性質(zhì)，黑碳粒子在氣-粒傳輸轉(zhuǎn)化過(guò)程中，能極強(qiáng)的吸附多種有毒化學(xué)物質(zhì)（如重金屬離子、多環(huán)芳烴、無(wú)機(jī)鹽等），并經(jīng)過(guò)復(fù)雜的非均相光化學(xué)反應(yīng)形成二次黑碳粒子（內(nèi)混態(tài)黑碳顆粒），即黑碳-污染物復(fù)合體（black carbon-pollutant composites，BC-PCs）[3-4]。盡管大量的流行病學(xué)研究表明，PM2.5的短期和長(zhǎng)期暴露能引發(fā)呼吸和心血管疾病以及過(guò)早死亡等一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題[5-8]。但是，由于PM2.5的來(lái)源多樣以及復(fù)雜的化學(xué)組分，導(dǎo)致對(duì)PM2.5誘發(fā)的毒性和健康效應(yīng)的研究結(jié)論仍然存在著爭(zhēng)議[9]。近年來(lái)，PM2.5中含碳顆粒組分（如BC、元素碳和有機(jī)碳）誘發(fā)的健康風(fēng)險(xiǎn)得到了流行病學(xué)證據(jù)的支持，如研究發(fā)現(xiàn)BC濃度與心血管疾病發(fā)生之間存在最強(qiáng)的相關(guān)性[1,3,6]。

毒理學(xué)研究也表明，來(lái)自不完全燃燒的BC顆粒在成纖維細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞中比PM2.5的毒性更強(qiáng)，并呈現(xiàn)出明顯的劑量和尺寸依賴效應(yīng)[1,5]。體內(nèi)毒理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)BC等碳粒子能活化炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放，誘發(fā)肺上皮細(xì)胞和泡巨噬細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肺部炎癥的發(fā)生[10]。目前，BC粒子可能是進(jìn)一步解析PM2.5誘發(fā)機(jī)體毒理效應(yīng)的關(guān)鍵組分之一，BC也被用于大氣毒理學(xué)和環(huán)境健康中PM2.5的替代物。

本研究以商業(yè)黑碳（C1864）為材料，通過(guò)測(cè)定黑碳誘發(fā)人肺泡上皮細(xì)胞（A549）的細(xì)胞活力，以及超氧化物歧化酶（intracellular superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化指標(biāo)，探究黒碳誘發(fā)A549細(xì)胞毒性與氧化損傷效應(yīng)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究黒碳誘發(fā)的細(xì)胞毒性作用機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺泡上皮細(xì)胞系（A549）由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院梅一德教授饋贈(zèng)，黑碳C1864購(gòu)自上海昊化化工有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司，D-MEM/F-12 培養(yǎng)基（Gibco，USA），PBS（BBI Life Science），10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FetalBovine Serum，F(xiàn)BS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶-EDTA 消化液(Gibco，Rockville，MD，USA)；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、微量丙二醛（MDA）試劑盒和過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶（75 cm2）中，在37℃、5%CO2(v/v)飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)A549細(xì)胞融合至80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞板，4×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞板，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)

稱取黑碳C1864材料，將其溶解于無(wú)菌的重蒸水中，配制為1 mg·mL-1的BC貯備液，使用前超聲處理使BC粒子分散均勻，用D-MEM/F-12完全培養(yǎng)液將BC貯備液，稀釋成終濃度為5、10、20、40、80 μg·mL-1。待細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 貼壁后，吸去上清液，用PBS洗滌，在96孔或6孔細(xì)胞板上分別加入不同濃度的BC染毒液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，設(shè)立陰性對(duì)照組（含有培養(yǎng)基加細(xì)胞，無(wú)BC染毒液）和空白對(duì)照組（僅有培養(yǎng)基）。

1.4 觀察指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 細(xì)胞活力的測(cè)定

采用 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測(cè)定處理組和對(duì)照組細(xì)胞活力的變化，嚴(yán)格按照MTT檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。簡(jiǎn)而言之，將1.0×105個(gè)/孔接種在96孔板中，處理組每孔加入不同濃度BC染毒溶液培養(yǎng)24 h，在490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)量光密度值。

1.4.2 細(xì)胞氧化指標(biāo)的測(cè)定

將4.0×105個(gè)/孔接種在6孔板中，處理組每孔加入不同濃度BC染毒溶液培養(yǎng)24 h后，從每個(gè)孔收集細(xì)胞培養(yǎng)液。嚴(yán)格按照SOD、LDH、MDA和CAT試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定不同濃度BC處理后LDH、MDA、CAT和SOD的活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

單因素方差分析（ANOVA）對(duì)各處理組間的相關(guān)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中*p＜0.05、**p＜0.01 和***p＜0.001 表示與對(duì)照組相比差異的顯著性水平。

2.結(jié)果分析

2.1 黒碳對(duì)細(xì)胞活力的影響

為了評(píng)估BC粒子誘發(fā)A549細(xì)胞的毒性效應(yīng)，將細(xì)胞暴露于BC粒子24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)和活力。隨著B(niǎo)C劑量的增加，在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞表面附著大量的BC粒子，細(xì)胞邊緣形狀不規(guī)則，細(xì)胞收縮崩解死亡，密度降低。我們進(jìn)一步采用MTT法測(cè)定了細(xì)胞活力。由圖1可見(jiàn)，黑碳處理24 h后，細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞活力與劑量之間呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性

提示A549細(xì)胞對(duì)BC粒子呈現(xiàn)較高的敏感性，如在5 μg·mL-1低劑量處理組，細(xì)胞活力的下降與對(duì)照相比差異顯著（p＜0.05），在 80 μg·mL-1高劑量處理組，細(xì)胞活力的下降與對(duì)照相比達(dá)到極顯著水平（p＜0.001）。

圖1 黒碳對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.2 黒碳對(duì)細(xì)胞膜的完整性影響

細(xì)胞膜是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡的重要屏障，LDH是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。我們進(jìn)一步測(cè)定了LDH的釋放量，以確證BC粒子對(duì)A549細(xì)胞的膜完整性影響。由圖2可見(jiàn)，不同劑量的BC粒子處理A549細(xì)胞24 h后，除了5 μg·mL-1處理外，其他劑量的處理LDH的釋放量均顯著的高于對(duì)照組，如80 μg·mL-1高劑量處理組LDH釋放量是對(duì)照組的2倍多；LDH的釋放量與BC劑量之間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性

LDH測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了MTT測(cè)定的細(xì)胞活力結(jié)果，提示BC粒子處理破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。

圖2 黒碳對(duì)細(xì)胞膜的完整性影響

2.3 黒碳對(duì)細(xì)胞氧化損傷的效應(yīng)

2.3.1 黒碳對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD是細(xì)胞中主要的抗氧化酶之一，SOD酶的活性反映了細(xì)胞的酶抗氧化能力。由圖3可見(jiàn)，除了 5 μg·mL-1處理外，不同劑量的 BC 粒子處理A549細(xì)胞24 h后，SOD活性與對(duì)照相比顯著下降（p＜0.05），80 μg·mL-1高劑量處理組的SOD活性下降達(dá)到了顯著水平（p＜0.01）。在10～40 μg·mL-1劑量的處理組中，SOD活性下降并未呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，進(jìn)一步分析SOD活性與劑量之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性

圖3 黒碳對(duì)超氧化物歧化酶活性的影響

2.3.2 黒碳對(duì)丙二醛（MDA）活性的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，MDA是氧化脅迫最關(guān)鍵標(biāo)志物。檢測(cè)MDA含量能進(jìn)一步了解膜脂過(guò)氧化的程度。圖4表明，不同劑量的BC粒子處理A549細(xì)胞24 h后，在 20和 40μg·mL-1較高劑量的處理組MDA含量與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；尤其是 80 μg·mL-1高劑量處理組，MDA含量與對(duì)照組相比達(dá)到了極顯著水平（p＜0.001），而且與其它劑量的處理組進(jìn)行比較MDA含量也達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）。這些結(jié)果提示BC粒子僅在較高劑量下對(duì)A549細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生損傷效應(yīng)，尤其以80 μg·mL-1處理最為明顯。

圖4 黒碳對(duì)丙二醛活性的影響

2.3.3 黒碳對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

過(guò)氧化氫酶（CAT）能夠促使過(guò)氧化氫（H2O2）分解為分子氧和水，清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，從而使細(xì)胞免于H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。由圖5結(jié)果可知，不同劑量的BC粒子處理A549細(xì)胞24 h后，CAT活力的下降與對(duì)照組相比均達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）；但在 5～40 μg·mL-1濃度處理組中，CAT活力并未呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，僅在80 μg·mL-1劑量處理組CAT活性下降達(dá)到了顯著水平（p＜0.01），進(jìn)一步分析表明CAT活性與劑量之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性

因此，不同濃度的BC粒子處理A549細(xì)胞后，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)CAT活力的顯著下降，表明BC粒子即使在低劑量下也能誘發(fā)A549細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，提示A549細(xì)胞對(duì)BC粒子毒性的高度敏感性。

圖5 黒碳對(duì)過(guò)氧化氫酶活性的影響

3 討論

人們?cè)絹?lái)越重視PM2.5的化學(xué)組分（如BC）對(duì)健康的不利影響[1,5,8]。盡管PM2.5中碳顆粒組分（如BC、元素碳和有機(jī)碳）誘發(fā)的毒性效應(yīng)和健康風(fēng)險(xiǎn)（如誘發(fā)呼吸系統(tǒng)和心血管疾?。?，已經(jīng)得到了體內(nèi)外模型和流行病學(xué)證據(jù)的支持，但在不同的研究中對(duì)BC等細(xì)碳顆粒物誘發(fā)機(jī)體的毒性效應(yīng)的結(jié)論還存在著爭(zhēng)議[1]。這些差異可能歸因于BC的不同來(lái)源（如機(jī)動(dòng)車或生物質(zhì)），尤其是BC吸附了許多污染物后更增加了黒碳毒性效應(yīng)的復(fù)雜性和不確定性[9-11]。盡管如此，由于黒碳粒子可控的形態(tài)和更簡(jiǎn)單的組成，研究已經(jīng)證實(shí)BC是評(píng)價(jià)PM2.5健康效應(yīng)的重要測(cè)量指標(biāo)[1,3,12]。因此，黒碳粒子模型有助于提高研究人員對(duì)不同來(lái)源的細(xì)顆粒成分（如機(jī)動(dòng)車或生物質(zhì)）或黒碳吸附特定有毒成分的毒性理解和認(rèn)識(shí)。

在本研究中，MTT數(shù)據(jù)顯示BC粒子能顯著的誘發(fā)A549細(xì)胞的毒性效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量-依賴效應(yīng)。值得注意的是即使在低劑量（5 μg·mL-1）的處理組，細(xì)胞活力的下降與對(duì)照相比也達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）。這與我們先前的研究碳黒粒子誘發(fā)人A549毒性效應(yīng)基本一致，并觀察到細(xì)胞表面附著大量的BC粒子，細(xì)胞邊緣形狀不規(guī)則，細(xì)胞收縮崩解死亡，密度降低[12]。我們進(jìn)一步使用透射電鏡檢查羧化黒碳粒子能夠被BEAS-2B細(xì)胞攝取，羧化BC粒子被內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中，但羧化黒碳粒子沒(méi)有穿透細(xì)胞核，并且羧化黒碳能顯著誘發(fā)BEAS-2B細(xì)胞的毒性和炎癥反應(yīng)[13]。

LDH是反映細(xì)胞膜損傷的靈敏指標(biāo)。事實(shí)上，細(xì)胞活力的下降這可歸因于A549細(xì)胞胞外乳酸脫氫酶（LDH）釋放和胞內(nèi)活性氧（ROS）生成水平的增加。前人的研究結(jié)果和我們先前的報(bào)道，已經(jīng)證明了PM2.5和黑碳粒子誘發(fā)產(chǎn)生的ROS能直接激活線粒體的通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致線粒體膜電位（MMP）和線粒體膜完整性喪失，過(guò)量的ROS生成和還原劑消耗可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡[1,10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的BC處理A549細(xì)胞后，隨著B(niǎo)C濃度的升高LDH的釋放量顯著的增加，如高劑量（80 μg·mL-1）處理組的 LDH 釋放量是對(duì)照組的2倍多，LDH的釋放量呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。對(duì)LDH數(shù)據(jù)與MTT法測(cè)定的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的相關(guān)性進(jìn)行分析表明，不同劑量BC處理組的LDH釋放量與細(xì)胞活力之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.01），提示BC粒子處理破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致了細(xì)胞活力下降。

細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化劑（如GSH）和抗氧化酶（如SOD、CAT），能夠防止產(chǎn)生過(guò)量的ROS形成后，ROS對(duì)各種細(xì)胞成分（如DNA、蛋白質(zhì)和脂類）的氧化損傷。事實(shí)上，許多研究已經(jīng)證實(shí)碳顆粒物（如黑碳、元素碳）誘發(fā)的氧化應(yīng)激或氧化損傷能夠?qū)е录?xì)胞自噬、凋亡或死亡[1,14-15]。在本研究中，不同劑量的BC處理A549細(xì)胞后，與對(duì)照相比超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性顯著下降，而丙二醛（MDA）的活性顯著上升，并且3種酶的活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。這些結(jié)果表明，BC誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的氧化損傷是通過(guò)SOD、CAT和MDA活性的改變而實(shí)現(xiàn)的。

4 小結(jié)

黑碳粒子對(duì)A549細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞內(nèi)氧化酶和抗氧化酶體系失失衡，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡。值得注意的是測(cè)定BC粒子對(duì)A549細(xì)胞的氧化脅迫指標(biāo)中，SOD和CAT的活力變化呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，但MDA含量的變化并未出現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。綜合分析這些研究結(jié)果提示，BC誘發(fā)的細(xì)胞膜完整性受損和氧化應(yīng)激可能在A549細(xì)胞毒性效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。關(guān)于BC誘發(fā)A549細(xì)胞毒性的分子作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。