卷丹百合脫毒與快繁技術(shù)研究

田山君， 裴 蕓， 牛力立， 田洪梅， 吳家麗， 張萬萍

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 2.安順市農(nóng)科院， 貴州 安順 561000；3.平塘縣經(jīng)濟(jì)作物推廣站， 貴州 平塘 558300)

百合是百合科百合屬多年生球根草本植物的總稱。食用百合肉質(zhì)鱗片含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等營養(yǎng)物質(zhì)及鈣、磷、鐵等營養(yǎng)元素，因為具有極高的營養(yǎng)價值，成為國內(nèi)外消費者喜好的蔬菜食品，具有非常廣闊的栽培和市場前景[1-3]。貴州銅仁、畢節(jié)等地長期采用鱗莖、鱗片等營養(yǎng)體進(jìn)行無性繁殖，不僅繁殖系數(shù)低、病毒積累嚴(yán)重，而且種球退化現(xiàn)象明顯，影響了食用百合的品質(zhì)和產(chǎn)量，在很大程度上制約了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國內(nèi)對百合組織培養(yǎng)技術(shù)的研究較多，但多集中在外植體的選擇、培養(yǎng)基中植物激素配比[4-6]等方面，對百合快速擴(kuò)繁過程進(jìn)行全方位的研究較少。本研究以貴州銅仁地區(qū)主栽的卷丹百合為材料，研究卷丹百合組織培養(yǎng)的最佳消毒方法、最適外植體及最適培養(yǎng)基配方，以期為食用百合的規(guī)?；敝臣伴_發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用百合于2017年4-5月采自貴州銅仁思南縣，為當(dāng)?shù)刂髟云贩N。MS為基本培養(yǎng)基，其他試劑NAA、6-BA、IBA等為分析純(AR)，均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體選取

選取生長健壯、無病害的鱗莖，經(jīng)熱處理和催芽處理后剝離出莖尖、莖段、葉片、鱗片，清洗消毒后晾干，留取核心部分鱗片，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)以26 ℃和45 ℃交替處理1個月(以下簡稱熱處理)，即白天45 ℃、夜間26 ℃，光照強度設(shè)定為1 500 lx。

1.2.2外植體消毒

待莖尖伸長2～3 cm時，將催芽培養(yǎng)后的百合鱗莖球剝?nèi)ネ鈱喻[片，先用75%的乙醇浸泡30 s，再用5%、10%、15% 3個濃度的次氯酸鈉溶液分別處理10 min、20 min。用無菌水沖洗3～5遍，吸去表面水分，剝?nèi)グ俸削[莖軸的鱗片，直至不帶葉原基的莖尖生長點，接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理接10瓶，每瓶接1個，10 d后統(tǒng)計污染率及成活率。

污染率(%)=(外植體中染菌的數(shù)量/接種的外植體總數(shù))×100%；

成活率(%)=[1-(死亡的外植體數(shù)量+愈傷失敗的外植體數(shù)量)/接種的外植體總數(shù)]×100%。

1.2.3培養(yǎng)基的配制及種類

基本培養(yǎng)基為MS，附加瓊脂粉4.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH為5.85。在不同的階段(誘導(dǎo)、增殖、生根壯苗)加入不同配比的植物激素，激素濃度設(shè)計按照文獻(xiàn)[7]、[8]的方法進(jìn)行，分化增殖階段及生根結(jié)鱗莖階段的激素配比見表1。

表1 不同培養(yǎng)基種不同激素配比

培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基編號不同種類及不同濃度的激素配比/(mg·L-1)6-BANAAIBA誘導(dǎo)分化及增殖培養(yǎng)10.10.120.10.530.11.040.50.150.50.560.51.071.00.181.00.591.01.0101.50.1111.50.5121.51.0132.00.1142.00.5152.01.0—生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)160.00.1170.00.2180.00.5190.50.120—0.50.2210.50.5221.00.1231.00.2241.00.5

1.2.4脫毒及誘導(dǎo)培養(yǎng)

1) 不同外植體篩選試驗。

將已催芽的鱗莖的莖芽、莖段、葉片和鱗片分離，鱗片的1～2層為外層，3～4層為中層，5層以內(nèi)為內(nèi)層。流水沖洗1 h后，先用75%乙醇消毒30 s，再用10%次氯酸鈉溶液消毒20 min，然后用無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙將表面水分吸干，接種到啟動培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1)上。每種外植體接種10瓶，每瓶1株，置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)(溫度26 ℃，光強2 000 lx，光照時間12 h·d-1)，培養(yǎng)2周后觀察污染情況，培養(yǎng)1月后觀察外植體的成活及分化情況。

2) 不同脫毒方法比較試驗。

設(shè)熱處理后分別剝?nèi)?.2～0.8 mm莖尖、1～3 mm莖芽、鱗片4個不同的脫毒方法，并以不經(jīng)熱處理直接剝?nèi)〉那o尖作為對照，均接種到啟動培養(yǎng)基上，離體培養(yǎng)成活后的組織，單個觀察培養(yǎng)、繁殖成無性系，并分留樣品，寄到云南省農(nóng)科院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所檢測脫毒情況。

3) 不同激素配比對莖尖誘導(dǎo)的影響試驗。

取消毒好的莖芽，剖取0.2～0.8 mm大小的莖尖，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1～15號)上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種15瓶，每瓶1個莖尖。培養(yǎng)溫度均為23～28 ℃，光培養(yǎng)的光照強度為2 000～3 000 lx，光照時間為12 h·d-1。每周進(jìn)行觀察，30 d以后統(tǒng)計鱗片分化數(shù)與不定芽生長數(shù)，計算誘導(dǎo)率。

1.2.5繼代增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)分化后得到的芽、愈傷組織等分成單株或小塊，分別轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基(1～15號)上，每個培養(yǎng)基接10瓶，每瓶接5株。置于培養(yǎng)室(溫度26 ℃，光強2 000 lx，光照時間12 h·d-1)。經(jīng)增殖生成的叢生芽、不定芽，再將其分割，繼續(xù)反復(fù)培養(yǎng)、增殖、壯苗，每周觀察記錄有效芽數(shù)(芽高大于0.5 cm)等增殖生長情況。

1.2.6生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)得到的無根苗和叢芽分割成單株，轉(zhuǎn)接到生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基(16～24號)上，每個培養(yǎng)基處理接10瓶，每瓶接5株苗。置于培養(yǎng)室(溫度26 ℃，光強2 000 lx，光照時間12 h·d-1)。每周觀察記錄，30 d后隨機抽取2瓶統(tǒng)計小鱗莖增殖數(shù)及新根發(fā)生條數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件結(jié)合DPS 15.10軟件進(jìn)行方差分析，分析方法按Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對卷丹百合外植體滅菌效果的影響

不同處理對卷丹百合外植體的表面滅菌效果影響如表2所示。次氯酸鈉濃度越高、處理時間越長，外植體的污染率越低，但隨著次氯酸鈉濃度的升高、處理時間的延長，外植體的成活率則出現(xiàn)下降，以10%濃度的次氯酸鈉處理20 min后的外植體成活率最高(60%)、污染率最低(40%)。

表2 不同處理對卷丹百合外植體滅菌效果的影響

處理編號次氯酸鈉濃度/%處理時間/min污染率/%成活率/%1510802025206040310105050410204060515105020615204020

2.2 不同部位外植體對擴(kuò)繁效果的影響

不同部位外植體的成活及分化情況見表3。百合不同部位的外植體分化效果差異顯著。在污染率方面，外層鱗片>中層鱗片>葉片、莖段>莖芽>內(nèi)層鱗片，且差異均達(dá)到極顯著水平。在成活率方面，內(nèi)層鱗片>莖芽>莖段、葉片、中層鱗片>外層鱗片，且差異均達(dá)到極顯著水平。在不定芽分化數(shù)方面，外層鱗片、莖芽>中層、內(nèi)層鱗片>莖段>葉片，差異均達(dá)顯著水平，需要注意的是，以莖芽、外層鱗片為外植體的不定芽分化數(shù)最高，在5.0～5.5之間，其次是中層、內(nèi)層鱗片，不定芽分化數(shù)為4.67，與莖芽、外層鱗片的不定芽分化數(shù)差異顯著，但未達(dá)極顯著水平。

卷丹百合的莖芽(圖版a)、葉片(圖版b)、鱗片(圖版c)和莖段(圖版d)作為外植體均可以成活，但中外層鱗片污染率高，成活率也低，莖段和葉片不定芽分化數(shù)低，內(nèi)層鱗片和莖芽由于有鱗片和葉片包裹不易被污染，滅菌效果較好，且成活率和不定芽分化數(shù)較高，可作為卷丹百合組培快繁外植體的最佳選擇。但作為外植體，莖芽數(shù)量相對鱗片較少，如果種球不多，需大量擴(kuò)繁時，內(nèi)層鱗片則是卷丹百合組培快繁外植體的最佳選擇，成活率可達(dá)70%，不定芽分化數(shù)為4.67。

表3 不同外植體滅菌處理效果

處理編號外植體污染率/%成活率/%不定芽分化數(shù)1莖芽50±2Dd50±5Bb5.00±0.23Aa2莖段60±4Cc40±2Cc3.33±0.37Bc3葉片60±2Cc40±2Cc1.67±0.34Cd4外層鱗片80±3Aa20±4De5.5±0.28Aa5中層鱗片70±1Bb30±4Cc4.67±0.33Ab6內(nèi)層鱗片30±5Ee70±5Aa4.67±0.33Ab

注：表中大寫字母表示差異達(dá)極顯著水平，小寫字母表示差異達(dá)顯著水平。下同。

2.3 不同脫毒方法比較試驗

隨機抽提各處理樣品負(fù)染色制片，利用JEM 100 CX-Ⅱ透射電子顯微鏡檢測，脫毒效果見表4。結(jié)果表明，A方法熱處理結(jié)合莖尖脫毒的效果最好，即經(jīng)26 ℃和45 ℃交替熱處理1個月后，剝?nèi)?.2～0.8 mm莖尖，2個檢測的樣品中，2號樣品未觀測到病毒顆粒，1號樣品在5萬倍下平均每視野1～5個病毒粒體，脫毒率為50%；其次是D方法，莖尖脫毒，雖然沒完全脫掉病毒，存在的病毒粒體較少，7號樣品在5萬倍下平均每視野少于1個病毒粒體，8號樣品，在5萬倍下平均每視野1～5個病毒粒體。而只經(jīng)熱處理，剝?nèi)〉妮^大莖芽和鱗片誘導(dǎo)的試管苗，病毒粒相對較多。檢測報告顯示：2號樣品已經(jīng)脫毒可以用于生產(chǎn)擴(kuò)繁，如急需擴(kuò)繁，7號樣品也可用。

表4 不同脫毒處理方法病毒檢測結(jié)果

脫毒方法樣品編號電子顯微鏡觀察結(jié)果A1號+SV(d～60nm)A2號—B3號+++SV(d～30nm)B4號+SV(d～40nm);+LVC5號++SV(d～30nm)C6號++SV(d～30nm);±SV(d～60nm)D7號±SV(d～30nm)D8號+SV(d～30nm)

注：“―”表示5萬倍下平均每視野未觀察到病毒粒體；“±”表示5萬倍下平均每視野少于1個病毒粒體；“+”表示5萬倍下平均每視野1～5個病毒粒體；“++”表示5萬倍下平均每視野6～10個病毒粒體；“+++”表示5萬倍下平均每視野11～15個病毒粒體；“SV”表示球形病毒；“LV”表示線形病毒；“d”表示直徑。

2.4 不同激素配比對莖尖誘導(dǎo)分化及增殖的影響

通過觀察發(fā)現(xiàn)，2周左右部分莖尖開始膨大成愈傷組織，4周后部分組織開始分化成不定芽，8周后百合莖尖長成苗，不同激素配比對卷丹百合莖尖誘導(dǎo)分化的影響如表5所示，不同濃度的6-BA、NAA配比對莖尖誘導(dǎo)率、增殖率和增殖倍數(shù)的影響達(dá)到顯著水平。誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基是10號、11號、13號、14號和15號，誘導(dǎo)率在80.00%～86.67%之間，平均分化葉片數(shù)在2.14～6.31之間，萌動時間10～15 d；增殖率最高的培養(yǎng)基是2號，增殖率達(dá)80%；增殖倍數(shù)最高的培養(yǎng)基是1號、2號，增殖倍數(shù)分別為4.25倍、4.88倍。

表5 不同處理間誘導(dǎo)率、增殖率及增殖倍數(shù)的差異

培養(yǎng)基編號誘導(dǎo)率/%平均分化葉片數(shù)/片萌動時間/d增殖率/%增殖倍數(shù)173.33±4.86BCbc2.901050±5.75CDd4.25±0.10Aa260.00±3.78DEde2.891180±4.67Aa4.88±0.46Aa360.00±4.91DEde2.441160±3.82BCc1.00±0.13Ee466.67±2.73CDcd2.701260±3.85BCc2.33±0.16Dc566.67±3.63CDcd2.801370±4.71ABb3.17±0.27Bb666.67±2.13CDcd2.001350±5.01CDd2.20±0.15Dc773.33±5.13BCbc2.551140±4.24De1.50±0.27Ed866.67±4.10CDcd1.601460±5.12BCc2.67±0.43CDc953.33±5.00Ee1.881140±4.55De1.00±0.13Ee1086.67±4.12Aa2.141220±3.89Ef3.50±0.18Bb1180.00±4.55ABab2.381550±2.40CDd2.40±0.26Dc1266.67±1.98CDcd2.40150Fg1.00±0.05Ee1380.00±1.89ABab2.831160±5.86BCc3.00±0.14BCb1486.67±3.98Aa3.921050±4.35CDd1.60±0.26Ede1586.67±5.24Aa6.311050±4.28CDd1.00±0.10Ee

表6 不同激素組合對外植體莖尖誘導(dǎo)率、增殖率及增殖倍數(shù)的影響

項目水平莖尖誘導(dǎo)率/%增殖率/%增殖倍數(shù)處理6-BA濃度(A)0.1/(mg·L-1)64.44±7.70Bc63.33±25.27Aa3.38±2.08Aa0.5/(mg·L-1)66.67±6.25ABbc60.00±10.00Aa2.57±0.53Aa1.0/(mg·L-1)64.44±10.18Bc53.33±11.55ABa1.72±0.86Aa1.5/(mg·L-1)77.78±5.18ABab46.67±15.17Bb2.30±1.25Aa2.0/(mg·L-1)84.45±3.85Aa23.33±5.77ABa1.86±1.03AaNAA濃度(B)0.1/(mg·L-1)76.00±7.60Aa46.00±16.73Aab2.92±1.06Aa0.5/(mg·L-1)72.00±10.95Aa62.00±13.04Aa2.94±1.22Aa1.0/(mg·L-1)66.67±12.47Aa40.00±23.45Ab1.24±0.54Ab變異來源A247.47*756.67*1.30B109.60646.67*4.76*

注：方差分析中影響水平以均方表示，“*”表示在0.05水平上顯著。下同。

方差分析結(jié)果(表6)表明，激素濃度對莖尖誘導(dǎo)率、增殖率和增殖倍數(shù)分別有著顯著影響(p<0.05)，其中，6-BA濃度顯著影響莖尖誘導(dǎo)率；NAA濃度顯著影響增殖倍數(shù)；2種激素濃度均顯著影響增殖率，又以6-BA濃度影響(均方值為756.67)最大，NAA濃度影響(均方值為646.67)次之。

由表6還可知，培養(yǎng)基中6-BA濃度較高時，有利于提高莖尖誘導(dǎo)率，在6-BA濃度為2.0 mg·L-1時，莖尖誘導(dǎo)率最高(84.45%)。較低濃度的6-BA有利于提高增殖率，在6-BA濃度為0.1 mg·L-1時的增殖率最高(63.33%)，而6-BA濃度對增殖倍數(shù)無影響。培養(yǎng)基中NAA濃度較低時，有利于提高增殖率和增殖倍數(shù)，在NAA濃度為0.5 mg·L-1時，增殖率和增殖倍數(shù)最高，分別為62%和2.94倍，而NAA濃度對莖尖誘導(dǎo)率無影響。

綜合表5和表6的結(jié)果認(rèn)為，卷丹百合的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為15號培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1，此條件下的誘導(dǎo)率達(dá)86.67%，接種10 d后能夠萌動，8周后的平均分化葉片數(shù)為6.31片；最適增殖培養(yǎng)基為2號培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，此條件下的增殖率、增殖倍數(shù)分別達(dá)80%、4.88倍。

2.5 不同激素配比對卷丹百合試管苗生根結(jié)鱗莖的影響

不同激素配比對卷丹百合試管苗生根結(jié)鱗莖的影響如表7所示，不同濃度的NAA、IBA配比對生根數(shù)、小鱗莖增殖倍數(shù)的影響達(dá)到顯著水平。卷丹百合在9種激素配比條件下都能生根，生根率都在70%以上，其中，23號培養(yǎng)基中的試管苗生根數(shù)最多，為12條；22號、23號培養(yǎng)基中的試管苗小鱗莖增殖倍數(shù)為最高，增殖倍數(shù)在6.0～6.2之間。

表7 不同處理間生根數(shù)及小鱗莖增殖倍數(shù)的差異

培養(yǎng)基號生根率/%生根數(shù)/條小鱗莖增殖倍數(shù)161002.2±0.2De1.5±0.1Dd17702.0±0.1De1.4±0.1Dd18702.4±0.1Dde1.8±0.1CDcd19803.0±0.3Dd1.5±0.1Dd201003.1±0.3Dd2.1±0.2Cc211006.3±0.3Cc4.2±0.1Bb22805.8±0.3Cc6.2±0.4Aa2310012.0±0.6Aa6.0±0.3Aa2410010.3±1.0Bb4.2±0.2Bb

圖版

方差分析結(jié)果(表8)表明，NAA濃度對卷丹百合試管苗的生根數(shù)、小鱗莖增殖倍數(shù)的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05)，而IBA濃度對生根結(jié)鱗莖影響不顯著，培養(yǎng)基中NAA濃度越高，越有利于卷丹百合生根結(jié)鱗莖，當(dāng)培養(yǎng)基中NAA濃度為1.0 mg·L-1時，試管苗生根數(shù)達(dá)到9.4條，小鱗莖增殖倍數(shù)為5.5倍。

表8 不同激素組合對試管苗生根數(shù)、小鱗莖增殖倍數(shù)的影響

項目水平生根數(shù)/條小鱗莖增殖倍數(shù)處理NAA濃度(B)0.1/(mg·L-1)2.2±0.2Ab1.6±0.2Ab0.5/(mg·L-1)4.1±1.9Ab2.6±1.4Ab1.0/(mg·L-1)9.4±3.2Aa5.5±1.1AaIBA濃度(C)0.1/(mg·L-1)3.7±1.9Aa3.1±2.7Aa0.5/(mg·L-1)5.7±5.5Aa3.2±2.5Aa1.0/(mg·L-1)6.3±3.9Aa3.4±1.4Aa變異來源B41.1*12.2*C5.90.1

綜合表7和表8的結(jié)果來看，卷丹百合最佳的生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基是23號：MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，小鱗莖的增殖倍數(shù)為6倍(見圖版e、圖版f)，生根率達(dá)100%(見圖版g)，平均根條數(shù)可達(dá)12條。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

3.1.1卷丹百合的脫毒

食用百合(卷丹)由于需求量增加，長期使用無性繁殖導(dǎo)致病毒感染嚴(yán)重。交替熱處理可使百合病毒受到抑制或鈍化，生長點快速伸長拉大病毒到達(dá)莖尖的距離，且外植體不易受到傷害，既方便了顯微操作，又提高了成活率。因此，常溫和高溫交替熱處理結(jié)合莖尖脫毒是有效的脫毒方法[9-10]。

莖尖大小決定了無病毒率，莖尖越小，無病毒率越高，但卻存在成活率較低、生長緩慢等弊端，降低了擴(kuò)繁的效率。今后的研究中要探討既能有效脫除病毒，又有較高的成活率和繁殖效率的方法，可以采用不同的外植體誘導(dǎo)成再生小鱗莖后，再進(jìn)行莖尖脫毒，這樣可以加大脫毒苗的成活率及繁殖系數(shù)。

3.1.2卷丹百合外植體的選擇

百合組織培養(yǎng)過程可以選擇鱗片、葉片、莖尖、莖段或花器官材料的部位，選擇外植體關(guān)鍵要看其取材的方便性、材料數(shù)量、材料部位、生理狀態(tài)、發(fā)育階段及取材時間是否有利于在初代培養(yǎng)中愈傷組織或不定芽的誘導(dǎo)，外植體的選擇是初代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[11-13]，通常說來，鱗片就其方便性及數(shù)量是優(yōu)于其它外植體的[14-16]。本試驗中，卷丹百合的莖芽、莖段、葉片和鱗片作為外植體均可以成活，但外層鱗片污染率高，而內(nèi)層鱗片和莖芽由于有鱗片和葉片包裹不易被污染，滅菌效果較好，且成活率和不定芽分化數(shù)較高，可作為卷丹百合組培快繁外植體選擇。但作為外植體，鱗片相對莖芽數(shù)量較多，且容易誘導(dǎo)成功，分化不定芽系數(shù)較高，因此在種球不多，需大量擴(kuò)繁時，內(nèi)層鱗片則是卷丹百合組培快繁外植體的最佳選擇，非常符合工廠化生產(chǎn)的需要。

3.1.3植物激素對卷丹百合誘導(dǎo)、增殖及生根結(jié)鱗莖的影響

6-BA與NAA的濃度水平是百合不定芽能否產(chǎn)生和增殖的主要因素，不同品種的百合在增殖時對激素濃度的要求有較大差異[17-19]。因此，在組織培養(yǎng)的過程中，要根據(jù)不同的品種進(jìn)行激素濃度的配比。本研究中，不加6-BA，只加NAA和IBA配比的生根培養(yǎng)基MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，也適合卷丹百合試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)，在生根的同時能結(jié)出小鱗莖，且小鱗莖增殖系數(shù)較高。生根率可達(dá)100%，小鱗莖的增殖倍數(shù)為6倍，可以同時作為增殖和生根培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。

3.2 結(jié) 論

在卷丹百合的組培快繁過程中，宜選擇內(nèi)層鱗片為外植體，外植體用75%的乙醇浸泡30 s后，再用10%次氯酸鈉消毒20 min，以26 ℃和45 ℃交替熱處理1個月后，剝?nèi)?.3～0.8 mm莖尖的脫毒效果較好；最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1；最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；最適生根結(jié)鱗莖培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。