大鯢活性肽與低分子量透明質(zhì)酸組合物抗氧化活性研究

關(guān)百婷，佟長青，李 偉

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023）

0 引言

透明質(zhì)酸，又稱玻尿酸，是一種分布于皮膚表皮與真皮中的酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）與葡萄糖醛酸（GlcA）二糖單位重復(fù)聚合形成[1]。低分子量透明質(zhì)酸平均分子量為1×106Da?？麓毫值热薣2]的研究表明，低分子量的透明質(zhì)酸具有小鼠巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。透明質(zhì)酸因其具有較好的保水作用，已經(jīng)成為重要的皮膚友好型化妝品原料，被廣泛添加于面膜、乳液、膏霜和化妝水中。同時(shí)，利用透明質(zhì)酸的天然交聯(lián)特性，研制出多種透明質(zhì)酸組合物。柳志喆等人[3]通過膠原蛋白和玻尿酸的天然交聯(lián)強(qiáng)化橡膠性質(zhì)物性的生體材料物質(zhì)，將膠原蛋白和玻尿酸混合，利用最佳混合比率和非化學(xué)性或物理性交聯(lián)的天然交聯(lián)條件，制作出具有橡膠特性的膠原蛋白和玻尿酸交聯(lián)物。陳海佳等人[4]發(fā)明了一種間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸的組合物，該組合物具有快速起效和間充質(zhì)干細(xì)胞作用時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)。Scott J E 等人[5]利用電子顯微鏡和計(jì)算機(jī)模擬等方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸具有三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸的這些特性為其開發(fā)成活性物質(zhì)的載體提供了巨大的潛力。

研究表明，大鯢肌肉中含有粗蛋白17.15%，水分84.04%，粗脂肪1.73%，灰分0.66%[6]。因此，大鯢肌肉具有較高的蛋白含量。大鯢肉的深度利用是通過酶解技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。大鯢蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶水解獲得的大鯢肽，往往具有多種生物活性，如增強(qiáng)免疫力、抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖等[7-8]。為了探討在化妝品領(lǐng)域應(yīng)用大鯢活性肽進(jìn)行了大鯢活性肽與透明質(zhì)酸組合物的制備，并對其抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢活性肽，分子量1 400～2 000 Da，由遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；低分子量透明質(zhì)酸（LMWHA-145 kDa），深圳潤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH·）（AR）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽 （2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid）diammonium salt，ABTS）（AR），美國Sigma 公司提供。

傅里葉變換紅外光譜儀，珀金埃爾默儀器有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FW-5A 型手動(dòng)壓片機(jī)，天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；UV-754 型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鯢活性肽與LMWHA 組合物的制備

將大鯢活性肽溶于pH 值為6 的濃度為0.01 mol/L PBS 中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液。將LMWHA 溶于pH 值為6 的0.01 mol/L PBS 中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液；按照1∶1 的體積，將上述2 種溶液混合，經(jīng)過納濾膜過濾，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到大鯢活性肽與透明質(zhì)酸組合物。

1.2.2 紅外光譜及顯微鏡觀察

稱取0.8 g 溴化鉀、0.002 g 大鯢活性肽與透明質(zhì)酸組合物、0.002 g 大鯢活性肽、0.002 g 透明質(zhì)酸于干燥皿中，置于105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量；稱取0.2 g 溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨至超細(xì)粉末進(jìn)行壓片，使其成為透明片，放于紅外機(jī)器中掃描為背景片，然后稱取0.2 g 溴化鉀與0.002 g 樣品，混合后放于瑪瑙研缽中研磨至超細(xì)粉末，進(jìn)行壓片后放入Frontier FT-IR 光譜儀（Perkin-Elmer）中測定樣品的FT-IR 光譜。

將大鯢活性肽與透明質(zhì)酸組合物溶于ddH2O 中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 DPPH·清除率的測定

將樣品配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的混合溶液。稱取10 mg DPPH 溶于無水乙醇中，定容至250 mL，配制成DPPH 工作液。分別加入不同濃度的樣品溶液3 mL，DPPH 工作液3 mL，混勻，置于避光環(huán)境中靜置30 min，在波長517 nm 處測定吸光度。按如下公式計(jì)算DPPH·清除率：

式中：A0——未加入樣品時(shí)DPPH 吸光度；

A1——未加入DPPH 時(shí)樣品的吸光度；

A2——樣品與DPPH 混合后的吸光度。

1.2.4 ABTS+·清除率測定

稱取0.020 6 g ABTS+·溶于5 mL 蒸餾水中，稱取0.003 5 g 過硫酸鉀溶于5 mL 蒸餾水中混勻暗反應(yīng)12 h 后，用蒸餾水稀釋到波長734 nm 處吸光度為0.7±0.02，用蒸餾水調(diào)零。分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL，ABTS 工作液4 mL，振蕩搖勻，室溫靜置6 min 后，在波長734 nm 處測吸光度。按如下公式計(jì)算ABTS+·清除率：

式中：A0——未加入樣品時(shí)ABTS 吸光度；

A1——未加入ABTS+·時(shí)樣品的吸光度；

A2——樣品與ABTS+·混合后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢活性肽與LMWHA 組合物的分析

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的大鯢活性肽的磷酸鹽緩沖液溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的LMWHA 磷酸鹽緩沖液溶液按照1∶1 的體積進(jìn)行混合，冷凍干燥后得到大鯢活性肽與LMWHA 組合物。對其進(jìn)行紅外光譜分析，紅外光譜的譜帶數(shù)目、形狀、位置及強(qiáng)度都隨著被分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而改變。

紅外掃描圖譜見圖1。

圖1 紅外掃描圖譜

從圖1 可以看出，大鯢活性肽與LMWHA 組合物與LMWHA、大鯢活性肽的紅外光譜圖具有較大的差別。大鯢活性肽的紅外光譜在3 528～2 867 cm-1表現(xiàn)出較寬的吸收峰，同時(shí)具有1 657，1 457，1 415，1 329，1 256，1 096，1 020，851，605 cm-1的特征峰，1 415 cm-1吸收為CN 伸縮及部分NH 彎曲振動(dòng)。LMWHA的紅外光譜特征吸收為3 408，2 880，1 624，1 508，1 409，1 292，1 240，1 209，1 157，1 065，909，897，622 cm-1的特征峰，其中1 624，1 409，622 cm-1為酰胺特征振動(dòng)峰，1 157，1 065，909 cm-1表明具有C-O-C 化學(xué)鍵，3 408 cm-1為羥基振動(dòng)峰。大鯢活性肽與LMWHA 組合物的特征峰為3 385，3 060，2 942，1 675，1 533，1 457，1 409，1 317，1 248，605，589 cm-1，這些特征峰即不同于大鯢活性肽的紅外光譜，也不同于LMWHA 的紅外光譜。這表明 2 種物質(zhì)形成組合物時(shí)其 O-H，N-H，C-O-C，C=O 都受到相互作用，說明該組合物是一種新的物質(zhì)。

將10%的溶于ddH2O 中的大鯢活性肽與LMWHA組合物溶液，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

大鯢活性肽與LMWHA 組合物顯微照片（放大40 倍）見圖2。

圖2 大鯢活性肽與LMWHA 組合物顯微照片（放大40 倍）

從圖2 可以看出，大鯢活性肽與LMWHA 組合物表現(xiàn)出自然交聯(lián)形成的結(jié)構(gòu)。

2.2 抗氧化活性測定

DPPH·與ABTS+·是常規(guī)使用的基于電子轉(zhuǎn)移原理進(jìn)行抗氧化活性的方法[9]。利用DPPH·方法測定的大鯢活性肽與LMWHA 組合物抗氧化活性，并與大鯢活性肽、LMWHA。

樣品質(zhì)量濃度對DPPH·的清除率的影響見圖3。

圖3 樣品質(zhì)量濃度對DPPH·的清除率的影響

從圖3 可以看出，在相同質(zhì)量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除DPPH·的能力與大鯢活性肽清除DPPH·的能力相當(dāng)。

利用ABTS+·方法測定的大鯢活性肽與LMWHA組合物抗氧化活性，并與大鯢活性肽、LMWHA。

樣品質(zhì)量濃度對ABTS+·的清除率的影響見圖4。

圖4 樣品質(zhì)量濃度對ABTS+·的清除率的影響

從圖4 可以看出，在相同質(zhì)量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除ABTS+·的能力顯著高于大鯢活性肽清除ABTS+·的能力。

溶劑對于DPPH·與ABTS+·方法測定抗氧化活性具有較大的影響。2 種方法的主要差別在于DPPH·需要利用乙醇來進(jìn)行溶解，而ABTS+·用水溶液來進(jìn)行溶解。在水溶液的環(huán)境下，大鯢活性肽與LMWHA組合物的抗氧化能力顯著提高。這也從另一個(gè)方面證明了大鯢活性肽利用LMWHA 的有三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)揮了更好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

在pH 值為6 的條件下，等量的大鯢活性肽與LMWHA 在溶液中形成了組合物。該組合物的紅外光譜呈現(xiàn)出了其獨(dú)特的吸收峰。顯微鏡觀察到大鯢活性肽與LMWHA 組合物表現(xiàn)出自然交聯(lián)形成的結(jié)構(gòu)。在相同質(zhì)量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物清除DPPH·的能力與大鯢活性肽清除DPPH·的能力相當(dāng)，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除ABTS+·的能力顯著高于大鯢活性肽清除ABTS+·的能力。因此，在大鯢活性肽與LMWHA 組合物中，大鯢活性肽利用了LMWHA 的有三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)揮了更好的抗氧化活性。