鮮干石斛水提物抗氧化活性差異比較

楊俊杰，干子健，代歡歡，郭 娜，張方艷

（合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230601）

石斛為傳統(tǒng)名貴藥材，在我國(guó)已有2 000 多年的藥用歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》 《本草綱目》等著作中就有記載，并列居上品[1]。石斛大多分布在哈巴450～900 m 的溫涼高濕地帶，受小環(huán)境相對(duì)溫度、濕度、光照等氣候因子影響較大[2]。人體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡中。但是人體與外界的接觸過程中，受到外界的影響導(dǎo)致人體內(nèi)的自由基不斷產(chǎn)生，過量的自由基會(huì)侵襲人體細(xì)胞組織，從而導(dǎo)致機(jī)體的氧化損傷，進(jìn)而引起機(jī)體衰老及各種疾病的發(fā)生[3-4]。而抗氧化劑能有效抑制自由基，因而尋找合適的抗氧化劑成為當(dāng)務(wù)之急。植物是抗氧化劑的主要來源之一，石斛是藥用植物中研究比較熱門的一類。通過大量的試驗(yàn)，人們已對(duì)石斛也有了一定了解。對(duì)不同品種石斛之間成分含量的差異也了解了許多。石斛中的主要有效成分為多糖和生物堿等[5]。藥理學(xué)研究表明，一些植物多糖有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗消化性潰瘍、降血脂、降血糖、抗腫瘤等方面的生物活性[6]。另外，通過對(duì)石斛提取物中的成分（如多糖）研究，發(fā)現(xiàn)這些成分對(duì)ABTS+·，DPPH·，NO 等均具有一定的清除能力[7-9]。對(duì)于石斛中的酮類及其他提取物的生化活性也有較多的研究[10-11]，但是同一品種新鮮石斛與干制石斛水提物抗氧化活性鮮有報(bào)道。試驗(yàn)在新鮮石斛干制比為5∶1的條件下比較鮮、干石斛水提物抗氧化活性差異，確定鮮條石斛炮制成干制石斛后其藥性的變化情況，從而提高新鮮石斛在干制過程中的利用率，并且為在某些藥品或保健品生產(chǎn)時(shí)用新鮮石斛代替干制石斛提供依據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮條金釵石斛、干制金釵石斛，產(chǎn)自廣西百色；鄰苯三酚、菲洛嗪等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2603 型電子天平，上海市安亭電子儀器廠產(chǎn)品；UV-Vis 型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；FA220 型分析天平，上海市安亭電子儀器廠產(chǎn)品；TA-XTplus 型粉碎機(jī)，超技儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9140 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PSB 型實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)，上海江東儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料處理

挑選飽滿鮮條金釵石斛，清洗后備用。干制金釵石斛截?cái)嗪蠓湃敕鬯闄C(jī)中充分粉碎，再用100 目篩2 遍后收集入袋中。

1.3.2 提取液的制備

（1）鮮條石斛水提物的制備。取20 g 鮮條石斛截成0.5 cm 左右的小段，加入50 mL 蒸餾水，浸泡1 h 后，加熱回流3 h。過濾后取濾渣，加入50 mL蒸餾水，再次加熱回流3 h。將2 次濾液合并后加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，將濃縮液置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min。取離心液上清液定容至200 mL，置于容量瓶中保存待用。

（2）干制石斛水提物的制備。取4 g 干制石斛粉加入50 mL 蒸餾水，加熱回流3 h。過濾后取濾渣，加入50 mL 蒸餾水，再次加熱回流3 h。將2 次濾液合并后加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，將濃縮液置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min。取離心液上清液定容，移至200 mL 容量瓶中保存待用。

1.3.3 對(duì)清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

稱取少量DPPH 溶液，加入無水乙醇配制成質(zhì)量濃度0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。然后分別取2 mL 不同質(zhì)量濃度（2， 4，6，8，10 mg/mL）的石斛水提物溶液，加入2 mL DPPH 溶液，混合均勻，放置于水浴鍋中25 ℃水浴20 min。然后，將其放入離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min。取上清液于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)吸光度。用維C 作為陽性對(duì)照。計(jì)算公式如下所示：

式中：A0——2 mL 無水乙醇+ 2 mL DPPH 溶液的吸光度；

A1——2 mL 樣品溶液+ 2 mL DPPH 溶液的吸光度；

A2——2 mL 樣品溶液 + 2 mL 無水乙醇的吸光度。

1.3.4 對(duì)Fe2+離子螯合能力的測(cè)定

分別取1mL不同質(zhì)量濃度（2，4，6，8，10mg/mL）的樣品溶液于試管中，加入3.7 mL 的蒸餾水，再加入 2 mmol/L 的 FeCl2溶液 0.1 mL 和 5 mmol/L 的菲洛嗪溶液0.25 mL，混合均勻后置于水浴鍋中，于25 ℃下水浴15 min，于波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定吸光度。以維C 為陽性對(duì)照。計(jì)算公式如下所示：

式中：A0——1 mL 蒸餾水代替反應(yīng)體系中樣品溶液的吸光度；

A1——樣品溶液反應(yīng)后的吸光度；

A2——0.1 mL 的蒸餾水代替反應(yīng)體系中的FeCl2溶液后的吸光度。

1.3.5 對(duì)超氧自由基清除率的測(cè)定

取 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液 （pH 值 8.2）4.5 mL于試管中，置于25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入1 mL 不同質(zhì)量濃度 （2，4，6，8，10 mg/mL）樣品溶液和25 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后放置于水浴鍋中，于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入8 mmol/L HCl 溶液1 mL 終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)以相同體積蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。以維C 為陽性對(duì)照。計(jì)算公式如下所示：

式中：A0——空白對(duì)照溶液吸光度；

A1——樣品溶液吸光度。

1.3.6 抗氧化活性的IC50值的測(cè)定使用軟件Origin Pro 7.5 計(jì)算抗氧化活性的IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮、干金釵石斛水提物對(duì)DPPH 自由基的清除效果比較

鮮、干石斛水提物對(duì)DPPH 自由基清除活性的比較見圖1。

從圖1 可以看出，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用。隨著石斛水提物質(zhì)量濃度的增大，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)DPPH 自由基清除效果也逐漸加強(qiáng)，且上升趨勢(shì)比較穩(wěn)定。在石斛水提物質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物都顯示了較強(qiáng)的對(duì)DPPH 自由基的清除能力，鮮條金釵石斛水提物對(duì)DPPH 自由基的清除率為62.1%，而干制金釵石斛為58.7%。從總體來說，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)DPPH 自由基清除效果弱于維C。當(dāng)鮮、干金釵石斛水提物質(zhì)量濃度相同時(shí)，鮮條金釵石斛水提物對(duì)DPPH 自由基清除效果強(qiáng)于干制金釵石斛水提物。

圖1 鮮、干石斛水提物對(duì)DPPH 自由基清除活性的比較

2.2 鮮、干金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除能力比較

鮮、干金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除活性的比較見圖2。

圖2 鮮、干金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除活性的比較

由圖2 可知，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)Fe2+均有較強(qiáng)的螯合清除作用，其螯合清除效果隨石斛水提物質(zhì)量濃度的增大而變強(qiáng)。在石斛水提物質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物均顯示了較強(qiáng)的對(duì)Fe2+螯合清除效果，鮮條金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除率為65.8%，而干制金釵石斛為62.6%。當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL 左右時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除能力與維C 的差距最大。同一質(zhì)量濃度下，干制金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除效果比鮮條金釵石斛水提物對(duì)Fe2+螯合清除效果差一些。

2.3 鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基清除活性的比較

鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基清除活性的比較見圖3。

圖3 鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基清除活性的比較

由圖3 可知，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基均有較強(qiáng)的清除作用。在石斛水提物質(zhì)量濃度為2～6 mg/mL 時(shí)，其清除超氧自由基能力上升趨勢(shì)較快；在質(zhì)量濃度為6～8 mg/mL 時(shí)，其清除自由基能力的上升趨勢(shì)開始變得平緩。同時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基的清除能力均小于維C。當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基的清除能力與維C 的差異并不明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg/mL 時(shí)，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基的清除能力與維C 的差距最大。此后，隨著質(zhì)量濃度的增加，鮮、干金釵石斛水提物對(duì)超氧自由基的清除能力與維C 的差距逐漸縮小。同一濃度下干制金釵石斛水提物清除超氧自由基的效果比鮮條金釵石斛水提物清除超氧自由基的效果差一些。

2.4 抗氧化活性的IC50 值

鮮、干石斛水提物抗氧化活性IC50見表1。

表1 鮮、干石斛水提物抗氧化活性IC50

由表1 可知，鮮、干金釵石斛水提物清除DPPH自由基和超氧自由基的螯合Fe2+等抗氧化試驗(yàn)中，鮮條金釵石斛水提物清除DPPH 自由基和超氧自由基，螯合Fe2+的IC50都小于干制金釵石斛。鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性要弱于維C 對(duì)照。

2.5 鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性差異顯著性分析

鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性差異顯著性分析見表2。

表2 鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性差異顯著性分析

由表2 可知，通過清除DPPH 自由基、螯合Fe2+、清除超氧自由基能力這3 種方法測(cè)定的鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性，兩者之間并不存在顯著差異。即鮮、干金釵石斛水提物抗氧化活性差異不大。

3 結(jié)論

從這3 種方法的試驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算所得抗氧化活性IC50可知，鮮條金釵石斛和干制金釵石斛的水提物都有較強(qiáng)的抗氧化活性。雖然鮮、干金釵石斛抗氧化活性并無明顯差異，但鮮條金釵石斛水提物的抗氧化活性高于干制金釵石斛水提物的抗氧化活性。由此說明鮮條石斛在干制過程中，受到外界環(huán)境或者干制技術(shù)的影響，使新鮮石斛中含有的某些抗氧化物質(zhì)遭到破壞，從而導(dǎo)致干制石斛中所含的抗氧化物質(zhì)含量降低。因此，從同一品種石斛的藥效來說，新鮮石斛的藥效優(yōu)于干制石斛。同時(shí)，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)是在新鮮石斛干制比為5∶1 的條件下生成的，而一般石斛干制比為5.5∶1 ～6.5∶1。由此可見，新鮮石斛干制過程中會(huì)損失一定的生物活性。