草魚(♀)×赤眼鱒(♂) F1及其親本CAST基因cDNA全長克隆與結(jié)構(gòu)差異

李東放 李耀國, 金生振 何美鳳 肖調(diào)義,

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心, 長沙 410128;2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 常德 415000)

魚類雜交一般指不同品種、品系、種、屬、亞科等親緣關(guān)系較遠的個體之間的交配[1], 其后代可獲得雜種優(yōu)勢, 在魚類育種工作中具有很大的利用價值[2—5]。遠緣雜交因親本遺傳差異明顯大于近緣雜交, 其雜交子代性狀具有更大的可塑性, 雜種優(yōu)勢往往表現(xiàn)更為明顯[6]。雜交子代在染色體和DNA水平上可以產(chǎn)生廣泛的變異, 是雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的基礎(chǔ)[7]。赤眼鱒俗稱“野草魚”, 與草魚同屬雅羅魚亞科, 具有較強的抗病能力[8]。已有研究表明, 正交F1(草魚♀×赤眼鱒♂)能正常存活, 且表現(xiàn)出優(yōu)于草魚的疾病抗性及肌肉品質(zhì)[9]。

魚類的肉質(zhì)品質(zhì)是評價其營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)[10,11]。李迪等[12]比較分析了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1的肉質(zhì)基本特性, 發(fā)現(xiàn)正交F1肌肉比父、母本彈性大、嫩度高, 肉質(zhì)更堅韌。李偉等[13]測定了草魚、赤眼鱒及正交F1背部肌肉的營養(yǎng)成分, 發(fā)現(xiàn)正交F1表現(xiàn)出肌肉彈性大、嫩度高和蛋白質(zhì)豐富等雜種優(yōu)勢。但正交F1肉質(zhì)特征的分子特性及遺傳基礎(chǔ)尚不明確。

蛋白酶系統(tǒng)參與肌原纖維降解過程, 通過鈣離子調(diào)控肌原纖維蛋白的性質(zhì)和比例而影響肉的硬度[14]。作為蛋白酶系統(tǒng)中的重要功能分子和影響肉質(zhì)嫩度的重要候選基因, 鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)可以特異性識別并抑制鈣蛋白酶(Calpain, CAPN)的表達及自溶穩(wěn)定性[15]; 最終降低CAPN降解蛋白的速度, 有助于肌肉生長[16]。目前已在鯉(Cyprinus carpio)[17]中克隆和鑒定了CAST基因。該研究克隆了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及其正交F1CAST基因的cDNA全長, 分析并比較三種魚該基因和蛋白結(jié)構(gòu)上的差異, 以期為正交F1肉質(zhì)的分子及遺傳特征研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

該研究所用的健康草魚、赤眼鱒及正交F1(草魚♀×赤眼鱒♂)均購于瀏陽市北盛鎮(zhèn)烏龍漁場, 所有試驗魚均為2018年5月繁育的個體, 平均體重(14.50±1.25) g, 購回后放于恒溫水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)28℃暫養(yǎng)1個月, 每箱放養(yǎng)草魚、赤眼鱒及正交F1各10尾, 每日按其體重的3%早、晚各投喂一次飼料。

1.2 RNA提取及cDNA合成

從養(yǎng)殖系統(tǒng)中選取健康草魚、赤眼鱒及正交F1各1尾, 分別取肌肉組織80 mg, 按總RNA提取試劑盒(Omega, 美國)說明提取總RNA, 用核酸蛋白儀檢測總RNA的質(zhì)量和濃度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取2 μg質(zhì)量和完整性好的RNA(A260/A280值在1.8—2.2), 按第一鏈 cDNA合成試劑盒(Fermentas, 美國) 的說明合成cDNA模板, 用于全長cDNA序列中間片段的克隆。參照SMARTer RACE 5′/3′ cDNA試劑盒 (Clontech, 美國) 說明書分別合成5′-RACE和3′-RACE cDNA模板, 用于5′/3′cDNA末端克隆。

1.3 CAST基因全長cDNA克隆

基于本課題組前期草魚轉(zhuǎn)錄組測序所得CAST基因部分序列(共1779 bp)以及GenBank中草魚CAST基因片段(登錄號: JF825477.1), 用Oligo7.0軟件設(shè)計草魚CAST基因3′ 和5′ 端的特異性擴增引物(表1), 分別以合成的草魚5′和3′-RACE cDNA為模板擴增對應(yīng)的末端序列。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 60s, 共30個循環(huán); 72℃延伸7min。將得到的目的片段PCR產(chǎn)物切膠回收, 克隆至pMD19-T載體, 挑取陽性克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序。赤眼鱒及正交F1CASTcDNA全長序列獲取參考已得到的草魚CASTcDNA序列, 使用Oligo7.0軟件設(shè)計引物; 分別以赤眼鱒第一鏈cDNA及正交F1第一鏈cDNA作為模板擴增中間序列; 赤眼鱒CAST與正交F1CAST5′/3′ cDNA末端序列的獲取同草魚。

1.4 CAST生物信息學(xué)分析

使用DNAStar軟件拼接獲得cDNA序列, 利用SMART (https://smart.embl-heidelberg.de)、SignalP 4.1 Server和ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam在線軟件分析氨基酸理化性質(zhì)、信號肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域等, 通過NetPhos 3.1 Server在線軟件預(yù)測蛋白磷酸化位點。使用BLAST在線比對分析序列的相似性, 通過DNAMAN對CAST蛋白進行多序列比對; 應(yīng)用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建CAST的系統(tǒng)發(fā)育樹(分支可信度設(shè)為1000次自展檢測); 使用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu) 和PYMOL軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行分析。

表1 本文所用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果

2.1 CAST cDNA全長序列分析

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及其正交F1的CASTcDNA全長序列已提交至GenBank, 獲得序列登錄號分別為KT780366.1、KU994884和KU994883。草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CASTcDNA序列全長分別為3036、3165和3086 bp; 其5′端非編碼區(qū)依次為104、118和136 bp, 開放閱讀框分別為 2706、2682和2715 bp, 3′端非編碼區(qū)依次為226、365和235 bp; 分別編碼901、893和904個氨基酸。利用Blast軟件比對結(jié)果顯示正交F1與母本草魚(♀)CASTcDNA全長序列的同源性為94.52%, 高于其與父本赤眼鱒(♂)的同源性(90%)。

2.2 CAST蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST的推導(dǎo)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為93.72、92.77和94.02 kD, 理論等電點依次為5.92、6.01和6.02。NetPhos3.1 Server預(yù)測草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST蛋白氨基酸殘基中潛在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸 (Thr) 和酪氨酸 (Tyr) 磷酸化修飾位點。結(jié)果表明, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST氨基酸殘基中分別潛在73個 (Ser: 49, Thr: 23, Tyr:1)、82個 (Ser: 54, Thr:26, Tyr: 2)和75個 (Ser: 51, Thr: 23, Tyr: 1) 磷酸化修飾位點。SMART軟件分析結(jié)果顯示, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂) 及正交F1均包含4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域, 正交F1與草魚對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域排布更為相似(圖1)。

使用I-TASSER和PYMOL軟件預(yù)測了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1的CAST蛋白三級結(jié)構(gòu)。預(yù)測的蛋白均由主要β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST分別擁有24、12和20個β-折疊, 在蛋白三級結(jié)構(gòu)上正交F1與草魚更為相近(圖2)。

2.3 CAST鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域差異比對

以草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1為核心對象,選擇金線鲃 (Sinocyclocheilus grahami)、鯉 (Cyprinus carpio)、斑馬魚 (Danio rerio)、爪蟾 (Xenopus laevis)、牛 (Bos taurus)及眼鏡王蛇 (Ophiophagus hannah)作為參照, 通過DNAMAN軟件對此9個物種CAST的4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域進行多序。

魚類CAST蛋白的4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域中都包含一個保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列(X代表任意氨基酸)。魚類的七肽序列具有高度保守性, 哺乳類、兩棲類和爬行類與魚類七肽序列存在部分差異。草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1的4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域序列中均包含高度保守的七肽序列, 其中正交F1與草魚對應(yīng)的4個七肽序列完全一致, 而與赤眼鱒第1和第4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域序列中的七肽序列一致; 赤眼鱒第2和第3個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域序列中的七肽序列與草魚和正交F1對應(yīng)序列均存在1個氨基酸殘基差異位點。

2.4 系統(tǒng)進化關(guān)系分析

對草魚(♀)、赤眼鱒(♂)、正交F1與不同分類地位物種的CAST進化關(guān)系進行分析(圖3), 整個系統(tǒng)發(fā)育樹可分為兩個大支: 硬骨魚類聚為一支, 鳥類、爬行類、兩棲類和哺乳類聚為另一支。在硬骨魚類中, 淡水魚 (如鯉、斑馬魚等)和海水硬骨魚類(如巴丁魚Pangasianodon hypophthalmus、虹鱒Oncorhynchus mykiss等)進化距離相對較遠; 正交F1和母本草魚(♀)進化關(guān)系較其與父本赤眼鱒(♂)更近。

圖1 CAST蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1 Structural feature analysis of CAST proteins

3 討論

為了更深入地了解草魚(♀)×赤眼鱒(♂)遠緣雜交后代的肉質(zhì)形成相關(guān)分子基礎(chǔ), 研究克隆獲得了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1三種魚的CASTcDNA全長序列, 并以此為基礎(chǔ)進行了三種魚CAST序列相似性、蛋白組成及修飾、功能結(jié)構(gòu)域特征以及系統(tǒng)進化關(guān)系的比較。就CAST而言, 各種不同層面的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果均提示正交F1與母本草魚(♀)遺傳信息更為接近。據(jù)此推測正交F1與母本草魚(♀) CAST蛋白結(jié)合Ca2+調(diào)節(jié)鈣蛋白酶活性的功能可能更相近[18]。

蛋白質(zhì)磷酸化是由蛋白質(zhì)激酶催化的磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng), 是常見且重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一[19], 亦是生物調(diào)節(jié)控制蛋白質(zhì)活力和功能的有效途徑[20]。真核生物中主要在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基位點發(fā)生磷酸化修飾[21]。該研究通過預(yù)測草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1磷酸化修飾位點, 獲知草魚CAST蛋白共有73個磷酸化位點, 赤眼鱒共有82個磷酸化位點, 而正交F1具有75個潛在磷酸化位點。正交F1與草魚(♀)的磷酸化位點相比僅相差2個絲氨酸磷酸化位點, 而與赤眼鱒存在1—3個數(shù)量不等的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點差異。磷酸化修飾位點數(shù)量多少可以直接影響到蛋白質(zhì)活性[22,23], 因而三種魚CAST蛋白的調(diào)節(jié)活性及功能可能存在差異。據(jù)此推測正交F1CAST蛋白活性與母本草魚更相似, 是偏向于受母本遺傳信息影響的雜交種。

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST蛋白均具有4個典型的鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域, 與鯉[17]等其他魚類中CAST蛋白研究結(jié)果相一致。CAST 4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域的任一結(jié)構(gòu)域均能抑制一種CAPN蛋白活性, 完整的 CAST 蛋白能夠同時抑制4個CAPN 蛋白分子[24]。對不同物種鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列分析發(fā)現(xiàn), 魚類CAST蛋白的4個鈣蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域均各包含一個保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列。該序列可能是CAST蛋白起抑制作用的關(guān)鍵部位, 魚類同哺乳類等該區(qū)域的差異可能導(dǎo)致CAST蛋白抑制CAPN的作用效果不同[25—27]。該研究發(fā)現(xiàn)正交F1與母本草魚(♀)七肽位點序列完全一致, 而與父本赤眼鱒(♂)存在部分位點的差異, 預(yù)示正交F1CAST抑制CAPN的功能與草魚更接近, 而同赤眼鱒可能存在差異[28]。此外, 相對于哺乳動物而言, 魚類CAST蛋白缺少了L結(jié)構(gòu)域; 雖然此結(jié)構(gòu)域的功能尚未明確, 但可能是魚類和哺乳類之間CAST序列同源性及功能差異形成的主要影響區(qū)域[29]。本研究團隊通過質(zhì)構(gòu)儀對正交F1及其親本的肉質(zhì)進行了測定, 研究結(jié)果顯示正交F1綜合了雙親的優(yōu)異肉質(zhì)特性, 呈現(xiàn)出彈性大, 嫩度高, 肉質(zhì)堅韌等品質(zhì);亦分析過CAST在草魚、赤眼鱒及其正交F1肌肉中的表達量, 結(jié)果顯示正交F1CAST基因表達量與赤眼鱒無顯著差異, 而顯著高于其母本草魚[12]。CAST基因表達量差異對肉質(zhì)的影響有待深入研究。

圖2 CAST三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 3D structure prediction of CAST

圖3 CAST系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of CAST

4 結(jié)論

該研究首次獲得了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST的cDNA全長序列, 發(fā)現(xiàn)正交F1CAST在序列同源性、蛋白組成和修飾、功能結(jié)構(gòu)域特征以及系統(tǒng)進化關(guān)系等方面與母本草魚(♀)更為接近;表明正交F1CAST功能可能與母本草魚(♀)更相似。所得數(shù)據(jù)為進一步解析鈣蛋白酶系統(tǒng)在魚肉品質(zhì)形成過程中的作用提供了分子基礎(chǔ)。