飼料中維生素D3的添加水平對(duì)黃顙魚幼魚生長(zhǎng)和Toll樣受體TLR18、TLR19和TLR21的影響

郭 勛 程 珂 馬春松 陳 昕 王春芳

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

維生素D是一種脂溶性維生素, 一般來(lái)說(shuō), 魚類不能合成維生素D, 必須依靠攝食來(lái)滿足其需求[1],維生素D3(VD3)是維生素D最重要的形式, 經(jīng)魚體吸收后轉(zhuǎn)化為活性維生素D3, 維生素D3與存在于細(xì)胞核內(nèi)的特異性受體(Vitamin D Receptor, VDR)結(jié)合后, 在基因轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮其重要的調(diào)控功能[2]。維生素D3的經(jīng)典作用主要是維持礦物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)、參與魚類內(nèi)分泌等[3], 除經(jīng)典作用外, 在哺乳動(dòng)物中越來(lái)越多的研究表明, 維生素D還可以影響免疫細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌和表達(dá), 從而影響免疫細(xì)胞的增殖和凋亡[4], 維生素D3還參與了蛋白質(zhì)激酶C(Protein Kinase C, PKC)、MAP激酶(Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK)、磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和磷脂酶D(Phospholipase D, PLD)等免疫相關(guān)通路[5,6], 相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明維生素D3也可以有效地干預(yù)病毒感染[7]。盡管這些報(bào)道表明維生素D3/VDR調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能在哺乳動(dòng)物中的作用, 但其對(duì)魚類營(yíng)養(yǎng)免疫的作用機(jī)理, 有待深入探索。

Toll樣受體(Toll-like Receptors, TLRs)是一類重要的病原體識(shí)別分子的受體(Pathogen Recognition Receptors, PRRs), 是溝通機(jī)體的先天免疫和獲得性免疫的橋梁[8]。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白, 主要有富含亮氨酸系列的胞外區(qū)、富含半胱氨酸系列的跨膜區(qū)和含TIR(Toll-interleukin-1 Receptot)的胞內(nèi)區(qū)3個(gè)典型的功能區(qū)組成, 胞外區(qū)能特異性識(shí)別病原體, 胞內(nèi)區(qū)能激活信號(hào)通路, 從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[9], 魚類TLR基因種類較哺乳類動(dòng)物更多, 目前在硬骨魚類至少發(fā)現(xiàn)了20種, 其中TLR18、19、20、21、22、23為魚類所特有[10], 不同的TLRs識(shí)別的病原體不同, 細(xì)胞外的TLRs主要檢測(cè)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的配體, 細(xì)胞內(nèi)的TLRs主要檢測(cè)核酸的配體[11]。已有研究表明,TLR18可以感受PGN(肽聚糖)、LPS(脂多糖)、Poly(I∶C)(聚肌細(xì)胞酸)和寄生蟲的刺激,除上述刺激物外,TLR19和TLR21還可以感受病毒的刺激[12], 三種基因特異性識(shí)別病原體后, 啟動(dòng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián), 從而導(dǎo)致免疫因子的產(chǎn)生[13], 然而其具體的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種, 由于其較高的市場(chǎng)價(jià)值, 黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模日益增大[14]。但在密集的養(yǎng)殖環(huán)境下, 細(xì)菌性傳染病發(fā)病的頻率越來(lái)越高, 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, “裂頭病”就是一種典型的黃顙魚疾病, 已有研究表明這種疾病是由鮰愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起的[15]。傳統(tǒng)的藥物治療法存在藥物殘留和耐藥性等安全問(wèn)題, 疫苗預(yù)防法存在操作復(fù)雜和特異性強(qiáng)的問(wèn)題。因此, 采用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段, 來(lái)增強(qiáng)黃顙魚對(duì)病原的抵抗力是防治相關(guān)疾病的有效措施之一[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究飼料中維生素D3的不同添加水平對(duì)鮰愛(ài)德華氏菌攻毒前后黃顙魚主要免疫組織中的三種典型Toll樣受體家族基因TLR18、TLR19和TLR21表達(dá)的影響, 以期揭示維生素D3在魚類免疫調(diào)控中的作用, 分析黃顙魚在營(yíng)養(yǎng)調(diào)控后對(duì)易感病原抵抗能力的變化, 初步篩選出提高黃顙魚免疫應(yīng)答的飼料中維生素D3的適宜水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料的制作

以酪蛋白和脫脂奶粉為蛋白源、玉米蛋白粉為糖源、大豆油為脂肪源配制成5組不同維生素D3含量等氮等能飼料, 飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。在飼料制作時(shí), 各原料采取逐級(jí)放大法混勻, 最后加入20%的蒸餾水揉勻, 經(jīng)制粒機(jī)加工后粉碎成適宜大小的顆粒, 37℃晾干至飼料水分低于10%,-20℃冰箱保存待用。

1.2 試驗(yàn)魚及其飼養(yǎng)

試驗(yàn)黃顙魚購(gòu)于武漢正好魚苗廠, 為了使試驗(yàn)魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境以及排除魚體殘存的維生素D3的影響, 正式試驗(yàn)前進(jìn)行為期3周的暫養(yǎng), 暫養(yǎng)期間投喂對(duì)照組飼料。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 試驗(yàn)魚饑餓24h后稱重, 挑選出體格健壯、規(guī)格一致的黃顙魚(5.0±0.2) g 800尾隨機(jī)放入循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的20個(gè)纖維玻璃魚缸中(內(nèi)徑85 cm內(nèi)高70 cm)。每組試驗(yàn)飼料對(duì)應(yīng)4缸重復(fù), 每缸40尾魚。養(yǎng)殖試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)樓附1樓013魚房?jī)?nèi)進(jìn)行。

生長(zhǎng)試驗(yàn)持續(xù)12周(2017.07.22—2017.10.17),采用飽食性投喂策略, 每天投喂2次(9:00 am和15:00 pm), 每天稱取定量的飼料(約為魚重的6%),投喂時(shí)采用多次少量投喂策略, 直至魚飽食為止,稱量剩余飼料量以確定投喂量, 每?jī)芍苋追Q重以調(diào)整投喂量, 試驗(yàn)期間水流約為1.5 L/min, 水溫為16.0—26.0℃, 溶解氧濃度大于6.0 mg/L, 氨氮濃度低于0.5 mg/L, pH在8.0左右。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分Tab. 1 Formulation and proximate composition of experimental diets

1.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 從每組中取24尾黃顙魚(每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取6尾), 稱重, 用于計(jì)算以下相關(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)。

式中,WG表示增重率;TGC表示積溫系數(shù);FCR表示餌料系數(shù);FE表示餌料效率;SUR表示存活率;FBW和IBW分別為魚體的末體質(zhì)量和初體質(zhì)量;d為養(yǎng)殖天數(shù),t為養(yǎng)殖水溫。

1.4 攻毒實(shí)驗(yàn)

在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 每個(gè)飼料組隨機(jī)選取55條黃顙魚, 注射鮰愛(ài)德華氏菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 細(xì)菌經(jīng)腦心浸液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion, BHI)培養(yǎng)后用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度稀釋為3.14×108CFU/mL(攻毒實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的致半死濃度), 每尾魚經(jīng)腹腔注射0.1 mL的菌液, 攻毒期間不喂食,水體充氧, 不循環(huán), 攻毒后6h開始觀察黃顙魚臨床癥狀, 記錄攻毒后黃顙魚的死亡數(shù), 計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的死亡率和免疫保護(hù)率, 其中免疫保護(hù)率(%)=100×(1-實(shí)驗(yàn)組死亡率/對(duì)照組死亡率); 并于攻毒前 (0)和攻毒后(72h) 采樣, 在每個(gè)采樣點(diǎn), 每個(gè)飼料組分別取6條魚的頭腎、脾臟、肝臟和前腸四個(gè)組織,另取6條新鮮黃顙魚的肌肉、頭腎、腎臟、皮膚、腦、鰓、脾臟、胃上皮、小腸和肝臟, 所有取出的組織立即放入液氮速凍, 然后放入-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)的測(cè)定

主要試劑和儀器 Trizol購(gòu)自Invitrogen公司, Sample Protector、DL2000DNA Maker、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion2.0)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶生生物工程(大連)有限公司, 熒光定量試劑盒HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)購(gòu)自翊圣生物科技(上海)有限公司。

引物的設(shè)計(jì)與合成利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的黃顙魚TLR18基因序列(GenBank: KY123645.1)、TLR19基因序列(GenBank: KY123646.1)、TLR21基因序列(GenBank: KY123647.1)和β-actin基因序列(GenBank: KM673246.1), 利用Primier5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)基因的引物, 引物由上海生工生物公司合成。

總RNA的提取和cDNA的合成取黃顙魚冷凍組織, 用trizol法提取其總RNA, 提取的總RNA用Nana Drop分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度,A260/A280值在1.8—2.0。瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶明亮清晰且28S條帶亮度是18S的兩倍。cDNA第一鏈的合成參照PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒方法進(jìn)行。首先進(jìn)行基因組DNA的除去反應(yīng)。反應(yīng)體系: 5× gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, Total RNA ＜1 μg, 加無(wú)菌蒸餾水至10 μL。反應(yīng)條件: 42℃2min。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系: 5× Prime Script?Buffer 2 (for Real time) 4 μL, PrimeScript?RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 基因組DNA除去反應(yīng)的反應(yīng)液10 μL, 加無(wú)菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件: 37℃ 15min, 85℃ 5s。合成的cDNA放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR以得到的cDNA為模板用Quan Studio 6 Flex RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增, Real-time PCR反應(yīng)體系: HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)10 μL, 上下游引物 (10 μmol/L) 各0.4 μL(表2), cDNA溶液2 μL, 加無(wú)菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件為: 95℃ 10s, 60℃ 20s, 72℃ 20s, 40個(gè)循環(huán)。

表2 Real-time PCR所用引物Tab. 2 Primers used for real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

mRNA表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析, 其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組, 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析, 若組間差異顯著(P＜0.05), 采用鄧肯檢驗(yàn)法(Duncan’s)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 飼料中維生素D3的添加水平對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

表3顯示, 在飼料中添加維生素D3對(duì)黃顙魚幼魚的TGC和存活率沒(méi)有影響(P＞0.05)。當(dāng)維生素D3添加濃度為16600 IU/kg時(shí), 黃顙魚增重率和飼料效率達(dá)到最大, 飼料系數(shù)最小(P＜0.05)。

表3 在飼料中添加維生素D3對(duì)黃顙魚幼魚生長(zhǎng)的影響Tab. 3 Effects of dietary vitamin D3 levels on the growth performance of juvenile P.fulvidraco

2.2 飼料中維生素D3的添加水平對(duì)活菌攻毒后黃顙魚的死亡率和免疫保護(hù)率的影響

表4顯示, 經(jīng)腹腔注射鮰愛(ài)德華氏菌后, 維生素D3濃度為1120 IU/kg時(shí), 黃顙魚累積死亡率達(dá)到最高, 且累積死亡率隨著飼料中維生素D3濃度的升高而增大, 免疫保護(hù)率隨著飼料中維生素D3的濃度升高而減小, 在維生素D3濃度為16600 IU/kg時(shí), 免疫保護(hù)率達(dá)到最大。

表4 在飼料中維生素D3添加水平對(duì)黃顙魚疾病抗性的影響Tab. 4 Effects of vitamin D3 supplementation on the disease resistance of P. fulvidraco

2.3 黃顙魚TLR 18、TLR19和TLR21基因的組織分布

以TLR19基因和TLR21基因mRNA表達(dá)量最低的肌肉為對(duì)照組, 以TLR18基因mRNA表達(dá)量最低的腦為對(duì)照組, 對(duì)肌肉、頭腎、腎臟、皮膚、腦、鰓、脾臟、胃上皮、小腸和肝臟中5種基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析, 得到黃顙魚體內(nèi)5種基因的mRNA組織表達(dá)分布圖(圖1), 3個(gè)TLR受體家族基因在各組織中都分布廣泛, 其中,TLR18基因在頭腎、脾臟和肝臟中的表達(dá)量較高(P＜0.05);TLR19基因在頭腎和脾臟中的表達(dá)量較高(P＜0.05);TLR21基因在脾臟中的表達(dá)量最高(P＜0.05)。

2.4 鮰愛(ài)德華氏菌刺激前后黃顙魚TLR18、TLR19和TLR21基因

TLR18基因mRNA表達(dá)量的變化由圖2可知, 相對(duì)于攻毒前水平, 攻毒后,TLR18 mRNA表達(dá)量在頭腎、脾臟、肝臟和前腸中就有提高, 頭腎中TLR18 mRNA的表達(dá)量在飼料VD3含量為2260和16600 IU/kg時(shí)顯著高于其他處理組, 在8030 IU/kg時(shí)表達(dá)量最低(P＜0.05); 脾臟TLR18 mRNA表達(dá)量隨飼料中維生素D3含量增加而下降(P＜0.05); 肝臟TLR18 mRNA表達(dá)量在16600 IU/kg時(shí)最高, 在3950 IU/kg時(shí)表達(dá)量最低(P＜0.05); 而在前腸中TLR18 mRNA表達(dá)量在低濃度維生素D3處理組(1120 IU/kg)顯著高于其他處理組(P＜0.05)。

TLR19基因mRNA表達(dá)量的變化由圖3可知, 和攻毒前相比, 在脾臟、肝臟、前腸以及高濃度VD3處理組的頭腎中, 攻毒后TLR19 mRNA的表達(dá)量均有所上升。頭腎高濃度VD3處理組(16600 IU/kg)該基因表達(dá)高于其他處理組, 但沒(méi)有顯著差異(P＞0.05); 在脾臟、肝臟和前腸中,TLR19 mRNA表達(dá)量總體上隨維生素D3水平升高顯著下降(P＜0.05)。

TLR21基因mRNA表達(dá)量的變化由圖4可知, 和攻毒前相比, 在頭腎、脾臟、肝臟和前腸中, 攻毒后TLR21 mRNA的表達(dá)量均高于攻毒前?？傮w來(lái)說(shuō), 攻毒后,TLR21 mRNA基因表達(dá)隨著飼料中VD3濃度的升高而呈下降趨勢(shì)(P＜0.05)。在4種免疫組織中, 高濃度VD3處理組(16600 IU/kg)該基因表達(dá)顯著低于其他處理組(P＜0.05)。

3 討論

Toll樣基因的mRNA廣泛的分布在硬骨魚類中的各個(gè)組織中, 但不同的TLR基因在不同的魚類表達(dá)模式不同。已有研究表明, 在斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)中,TLR18、TLR19和TLR21在脾臟或是在肝臟中表達(dá)量最高, 在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較少[17],TLR18在大西洋鮭(Salmo salar)的頭腎分布較少, 在肝臟中分布最高,TLR19和TLR21在大西洋鮭的頭腎和脾臟中表達(dá)量最高[18],TLR21在草魚(Ctenopharyngodon idellus)的皮膚、頭腎和脾臟中表達(dá)量相對(duì)較高[19]。在本研究中,TLR18、TLR19和TLR21在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá), 其中,TLR18在脾臟中表達(dá)量最高, 但在頭腎和肝臟中同樣高表達(dá), 而TLR19和TLR21在脾臟中的表達(dá)量顯著高于其他組織, 其次為頭腎組織。本結(jié)果證實(shí)了Wang等[20]在黃顙魚中的發(fā)現(xiàn), 但與其他魚中已有的研究成果有所不同, 可能是由于物種的差異性, 同一基因的mRNA在不同魚類的分布具有特異性。

圖1 黃顙魚TLR18 (A)、TLR19 (B)和TLR21 (C)基因mRNA組織表達(dá)分布Fig. 1 Tissue distribution of TLR18(A), TLR19(B), and TLR21(C) mRNA in Pelteobagrus fulvidraco

圖2 攻毒前后TLR18 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 2 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR18 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

圖3 攻毒前后TLR19 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 3 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR19 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

炎癥是機(jī)體自身的一種保護(hù)性反應(yīng), 以確保消除有害刺激, 修復(fù)受損組織的愈合過(guò)程, 微生物對(duì)細(xì)胞的感染會(huì)激活炎癥反應(yīng), 感染的初始由先天模式識(shí)別受體(PRRs)介導(dǎo)[21], TLRs是最常見的PRRs,TLRs識(shí)別特定的配體, 然后通過(guò)MyD88(Myeloid Differentiation Factor 88)信號(hào)通路或者TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β)信號(hào)通路, 激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear Factor κB, NF-κB), 進(jìn)而產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[22]。到目前為止, TLR家族可以分為TLR1/3/4/5/7/11六種亞家族, 我們當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的主體是TLR18、TLR19和TLR21。TLR18是魚類特有的基因, 隸屬于TLR1亞家族, 已經(jīng)被證明在硬骨魚類的免疫中有重要作用[23]。TLR19和TLR21都屬于TLR11亞家族, 大部分TLR11亞家族的成員都僅在魚類和青蛙中發(fā)現(xiàn)[24]。TLR18與哺乳動(dòng)物中的TLR6和TLR10類似, 用嗜水氣單胞菌感染草魚后, 草魚體內(nèi)的TLR18表達(dá)量會(huì)顯著升高, 從而激活NF-κB通路, 發(fā)生炎癥[25]。TLR19基因序列非常保守, 優(yōu)先作用于細(xì)胞內(nèi), 能夠準(zhǔn)確識(shí)別寄生蟲的感染, 研究已經(jīng)證實(shí)TLR19和斑點(diǎn)叉尾鮰抗小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)的免疫反應(yīng)相關(guān)[26],TLR21結(jié)構(gòu)與TLR11相似, 牙鲆(Paralichthy solivaceus)受到鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染后, 體內(nèi)的TLR21表達(dá)量上調(diào)[27]; 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)中TLR21和抗海水白點(diǎn)蟲病(Cryptocaryon irritans)的免疫反應(yīng)相關(guān)[28]。由于TLR18、TLR19和TLR21在病原識(shí)別后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相似性比較高[29], 因此我們可以將此三個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行研究。在本研究中, 我們探討了飼料中添加不同含量維生素D3喂養(yǎng)12周后, 再經(jīng)過(guò)鮰愛(ài)德華氏菌攻毒后, 脾臟、頭腎、肝臟和前腸中TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá)。結(jié)果表明: 和攻毒前相比, 四個(gè)組織中攻毒后TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá)都顯著上升。這一結(jié)果與Wang等[20]在對(duì)經(jīng)過(guò)LPS和Poly(I∶C)刺激后黃顙魚中報(bào)道的結(jié)果一致:TLR18、TLR19和TLR21在脾臟、肝臟、頭腎和血液中的表達(dá)量均增高。與斑點(diǎn)叉尾鮰中結(jié)果部分一致: 愛(ài)德華氏菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰后, 其肝臟和脾臟中的TLR18、TLR19和TLR21表達(dá)量顯著上調(diào), 但頭腎中的TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著下調(diào)[30]。本研究中的結(jié)果和文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果都表明,TLR18、TLR19和TLR21在針對(duì)革蘭氏陰性/陽(yáng)性細(xì)菌和病毒的免疫應(yīng)答中都起重要作用, 促進(jìn)了炎癥的發(fā)生。至于愛(ài)德華氏菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰后頭腎中此3個(gè)基因表達(dá)模式與黃顙魚不一致, 也許存在物種特異性, 具體原因還有待進(jìn)一步研究。

維生素D3是一種具有廣泛生理效應(yīng)的內(nèi)分泌激素, 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)機(jī)體免疫影響的機(jī)制在分子水平上可以分為兩種, 第一種是維生素D3與免疫細(xì)胞的VDR結(jié)合, 影響細(xì)胞的增殖分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生; 第二種是維生素D3可以活化免疫細(xì)胞的Toll樣受體, 從而發(fā)揮免疫作用[31], 魚類此方面的研究較少, 有關(guān)維生素D3在魚類免疫中作用及機(jī)制仍待深入探索。已有研究表明適宜的維生素D3添加量可以顯著的提高歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)[32]、黃鱔(Monopterus albus)[33]和金頭鯛(Sparus auratus)[34]相關(guān)免疫基因在免疫組織中的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明, 飼料中不同的維生素D3的添加水平顯著影響TLR18、TLR19和TLR21在黃顙魚頭腎、脾臟、肝臟和前腸4個(gè)組織中的表達(dá), 不論是攻毒前還是攻毒后, 維生素D3對(duì)此三個(gè)基因的影響都存在濃度劑量關(guān)系, 證實(shí)維生素D3對(duì)黃顙魚免疫的調(diào)節(jié)作用。總體而言, 以組織表達(dá)量最高的脾臟為例,TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá)基本隨著飼料中維生素D3含量的增加而下降, 表明飼料中適宜濃度的維生素D3會(huì)促進(jìn)TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá), 高濃度的維生素D3會(huì)抑制TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá), 維生素D3通過(guò)影響相關(guān)免疫基因的表達(dá)從而避免了魚體細(xì)菌感染的發(fā)生。

圖4 攻毒前后TLR21 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR21 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

4 結(jié)論

本研究探討了黃顙魚幼魚經(jīng)過(guò)為期12周的維生素D3營(yíng)養(yǎng)調(diào)控后, 再經(jīng)致病菌攻毒后, 維生素D3的添加對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)和Toll類受體TLR18、TLR19和TLR21表達(dá)的影響。結(jié)果顯示, 適宜維生素D3濃度促進(jìn)黃顙魚生長(zhǎng)和Toll類受體TLR18、TLR19和TLR21表達(dá), 并發(fā)現(xiàn)TLR18、TLR19和TLR21在不同組織中的表達(dá)和飼料中維生素D3的濃度相關(guān), 本研究結(jié)果證實(shí)了飼料中添加合適劑量的維生素D3, 可以促進(jìn)相關(guān)免疫基因的表達(dá), 從而增強(qiáng)黃顙魚對(duì)病原微生物的抵抗力, 高濃度的維生素D3會(huì)抑制TLR18、TLR19和TLR21的表達(dá), 維生素D3通過(guò)影響相關(guān)免疫基因的表達(dá)從而避免了魚體細(xì)菌感染的發(fā)生。本結(jié)果為采用添加合適劑量的維生素D3來(lái)增強(qiáng)魚類的免疫能力, 制作能提高魚類免疫力的飼料提供了研究基礎(chǔ)。