三氧化二砷抑制秀麗線蟲生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖

于 敏， 劉天驕， 游 牧， 王順昌

(1. 安徽大學(xué) 學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)編輯部， 合肥 230039; 2. 淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院， 淮南 232038; 3. 淮南師范學(xué)院 資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 淮南232038)

無機(jī)砷是公認(rèn)的環(huán)境致癌劑、致畸劑和致突變劑，急性砷暴露導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹瀉、背部疼痛甚至死亡，長(zhǎng)期低劑量砷暴露與皮膚癌、肺癌和肝癌等癌癥高發(fā)相關(guān)聯(lián)[1]。但三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)等無機(jī)砷化合物又被長(zhǎng)期用來治療梅毒、牛皮癬等多種疾??；ATO已成為治療急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的一線臨床用藥[2]。無機(jī)砷化合物還具有治療肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等實(shí)體瘤的潛力[3]。ATO治療APL的主要機(jī)制是下調(diào)PML-RARα融合蛋白活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[4]。

腫瘤抑制基因p53具有調(diào)控機(jī)體DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等功能，是重要的腫瘤監(jiān)控基因。p53是否在ATO治療腫瘤中發(fā)揮作用，目前還存在一定的爭(zhēng)議。如ATO誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡依賴于p53的作用[5]；而ATO誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡與p53的狀態(tài)相關(guān)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的部分原因是約有50%的腫瘤細(xì)胞存在p53功能異常；由于細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在p53的旁系同源(paralog)基因p63和p73，它們?cè)趐53突變的細(xì)胞仍具有促進(jìn)凋亡的功能，從而干擾了對(duì)p53作用機(jī)制的評(píng)價(jià)[6]。因此，p53基因在ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用尚需進(jìn)一步探討。

基于上述原因，以具有單一p53基因的模式生物為對(duì)象，可以更好地研究p53是否與ATO腫瘤治療相關(guān)。秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans) 因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。近十余年來，秀麗線蟲也被用來進(jìn)行抗癌藥物的篩選[7]。盡管秀麗線蟲成體體細(xì)胞不再增殖分化，但其生殖細(xì)胞終身保持分裂分化能力，并受到保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。秀麗線蟲cep-1是其唯一的p53基因，該基因在輻射誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。秀麗線蟲gld-1基因在卵子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，秀麗線蟲gld-1(q485)突變導(dǎo)致生殖細(xì)胞不受調(diào)控地增殖，從而導(dǎo)致蟲體提前死亡[9]。因此，攜帶gld-1(q485)突變的秀麗線蟲生殖腺具有腫瘤樣增殖，成為研究腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)控的可替代模型。本文以具有單一p53樣基因的秀麗線蟲為對(duì)象，研究CEP-1/p53基因在ATO抑制生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 秀麗線蟲品系與試劑

實(shí)驗(yàn)所使用的秀麗線蟲品系包括N2 野生型、突變體gld-1(q485)、cep-1(gk138)、cep-1(lg12501) 和cep-1(w40)等；其中g(shù)ld-1(q485)突變體生殖腺呈現(xiàn)腫瘤樣增殖。所有線蟲品系均來自美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)國(guó)際線蟲種質(zhì)中心(Caenorhabditis Genetics Center, CGC)。實(shí)驗(yàn)所用的RNAi 菌株購自Source BioScience公司(Nottingham, UK)。對(duì)照菌L4440購自Addgene 公司(Cambridge, USA)。As2O3和IPTG為Sigma公司產(chǎn)品(St Louis, USA)，吖啶橙(AO)和DAPI購自Molecular Probes公司(Eugene, USA)。

1.2 秀麗線蟲處理

線蟲的培養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[10]，所有品系的秀麗線蟲均在20 ℃下培養(yǎng)，以大腸桿菌OP50為食物。為使蟲體達(dá)到同步化生長(zhǎng)，將成蟲以次氯酸鈉和氫氧化鈉裂解，離心收集受精卵并在M9緩沖液內(nèi)孵化，在不供給食物情況下，線蟲停滯在L1期，當(dāng)接種到含有OP50培養(yǎng)基上后，可以達(dá)到同步化生長(zhǎng)[10]。將ATO以含有OP50的K-medium稀釋后，加至12孔板內(nèi)，每孔1 mL，并加入待處理線蟲20條。

1.3 壽命測(cè)定

將同步化的早期成蟲轉(zhuǎn)移至含有不同劑量ATO的12孔板內(nèi)，每孔20條。在體視顯微鏡下，每日檢查死亡個(gè)體數(shù)目并轉(zhuǎn)板一次。對(duì)于N2線蟲，對(duì)鉑金針觸碰無反應(yīng)者視為死亡，對(duì)于gld-1(q485)突變體，咽泵不再跳動(dòng)或蟲體崩解便視為死亡。

1.4 生殖細(xì)胞增殖

生殖腺增殖測(cè)定采取DAPI染色法，將處理后的線蟲置于含有一滴K-medium載玻片中央，以7號(hào)注射器針頭從咽部切開蟲體，待生殖腺釋放出來后，卡諾氏液固定，空氣干燥，加入1滴2 μg/mL的DAPI溶液和1滴5%丙基沒食子酸甘油溶液，指甲油封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。N2線蟲只統(tǒng)計(jì)有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目，而gld-1(q485)則統(tǒng)計(jì)自生殖腺遠(yuǎn)端開始50 μm長(zhǎng)度的生殖細(xì)胞數(shù)目。

1.5 細(xì)胞凋亡測(cè)定

凋亡細(xì)胞測(cè)定采用AO活體染色法[11]，將處理后的線蟲轉(zhuǎn)移至12孔板內(nèi)，在含有少量OP50的M9中，以25 μg/mL的AO染色60 min，再轉(zhuǎn)移至3.5 cm的NGM板上恢復(fù)60 min，以排出腸管內(nèi)的染料，最后將線蟲轉(zhuǎn)移至含有1滴10 mmol/L NaN3的載玻片中央，在Zeiss Imager A2熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)橙黃色。

1.6 RNAi

采用喂飼攜帶目標(biāo)基因的E.coliHT115(DE3)方式進(jìn)行RNA干擾(RNA interference, RNAi)實(shí)驗(yàn)[12]。將攜帶cep-1基因的HT115菌株在含有50 μg/mL羧芐西林和1.25 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)16 h，挑取單菌落接種于含有50 μg/mL羧芐西林的LB內(nèi)，振蕩培養(yǎng)16 h，吸取培養(yǎng)液200 μL鋪于6 cm含有50 μg/mL羧芐西林和1 mmol/L IPTG的NGM上，室溫放置誘導(dǎo)24 h，即為RNAi喂飼培養(yǎng)板，將約200條L1期線蟲接種于該板內(nèi)，待發(fā)育為早期成蟲后，目標(biāo)基因即被敲除，實(shí)驗(yàn)使用L4440質(zhì)粒作為空白對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

平均壽命分析采用Mantel-Cox log rank 檢驗(yàn)，不同劑量之間的差異采用ANOVA的Tukey多重比較或Student′st-檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATO延長(zhǎng)具致死性生殖腺腫瘤線蟲的壽命

ATO暴露導(dǎo)致N2線蟲壽命縮短，并具有顯著的劑量效應(yīng)(圖1-A)，表明ATO對(duì)N2線蟲具有毒性效應(yīng)。gld-1(q485)突變導(dǎo)致生殖腺不受控制地分裂，呈現(xiàn)腫瘤樣增殖，導(dǎo)致平均壽命遠(yuǎn)短于野生型[9]。在不同劑量ATO的作用下，gld-1(q485)線蟲平均壽命不僅沒有縮短，反而呈現(xiàn)延長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖1-B)。平均壽命從對(duì)照組的(13.0±0.70) d增加至25 μmol/L時(shí)的(16.58±0.66) d，而N2的平均壽命則從(19.67±0.42) d降低至(16±0.68) d， 見圖1-C，表明ATO延長(zhǎng)了罹患生殖腺腫瘤的秀麗線蟲壽命。

A：不同劑量ATO處理對(duì)N2線蟲壽命的影響；B：不同劑量ATO處理對(duì)gld-1(q485)致死性生殖腺腫瘤線蟲壽命的影響；C：N2和gld-1(q485)平均壽命的比較

圖1ATO延長(zhǎng)致死性生殖腺腫瘤的線蟲壽命

Figure 1 ATO extends lifespan of worms with lethal gonad tumors

2.2 ATO抑制gld-1(q485)線蟲生殖腺腫瘤樣增長(zhǎng)

攜帶gld-1(q485)突變的線蟲生殖腺具有與腫瘤組織相似的特點(diǎn)，即細(xì)胞增殖不受機(jī)體的調(diào)控，gld-1(q485)線蟲在正常培養(yǎng)條件下，由于生殖細(xì)胞過度增殖，使得蟲體體腔甚至頭部均充滿了生殖細(xì)胞，從而導(dǎo)致蟲體死亡，因而攜帶gld-1(q485)的線蟲品系可以視作腫瘤模型[13]。為了研究ATO延長(zhǎng)gld-1(q485)線蟲壽命的作用機(jī)制，對(duì)ATO處理后第1天和第4天的生殖腺進(jìn)行了分析。以25 μmol/L ATO處理第1天，對(duì)照組和ATO處理組具有相似比例的生殖腺過度增殖比例；伴隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組生殖腺過度增殖并發(fā)生破裂的比例顯著增加，一些生殖細(xì)胞因過度增殖而游離出來，使得咽部受擠壓而嚴(yán)重變形(圖2-B)，ATO處理降低了生殖腺過度增殖的線蟲比例(P<0.05，圖2-C)。這一結(jié)果顯示，ATO抑制gld-1(q485)線蟲生殖細(xì)胞過度增殖，延長(zhǎng)其平均壽命。

A：25 μmol/L ATO處理，DIC顯微鏡照片，箭頭所指處生殖腺邊界清晰；B：對(duì)照組，所示生殖腺邊界不清晰，箭頭所示游離生殖細(xì)胞擠壓咽部；C：ATO處理第1天和第4天具有生殖腺腫瘤樣增長(zhǎng)的個(gè)體比例。

圖2ATO抑制gld-1(q485)線蟲生殖腺腫瘤樣增長(zhǎng)

Figure 2 ATO inhibited tumor-like growth of the gonad in worms ofgld-1(q485)

2.3 ATO抑制秀麗線蟲生殖細(xì)胞增殖

ATO誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[14]。對(duì)照組第4天N2有絲分裂區(qū)的生殖細(xì)胞數(shù)目顯著降低，但gld-1(q485) 生殖細(xì)胞數(shù)目顯著增加，呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)ATO劑量達(dá)到10.0 μmol/L時(shí)，不僅N2的生殖細(xì)胞增殖受到顯著抑制(圖3-A)，gld-1(q485)的生殖細(xì)胞增殖也受到顯著抑制。與第1天相比，在10.0 μmol/L或25.0 μmol/L劑量下，第4天gld-1(q485)的生殖細(xì)胞數(shù)目并未顯著增加(圖3-B、C、D)，這表明ATO誘導(dǎo)gld-1(q485)生殖細(xì)胞周期停滯，抑制其生殖腺腫瘤樣增殖。為研究p53基因是否與細(xì)胞周期停滯有關(guān)，利用RNAi敲除gld-1(q485)的p53同源基因cep-1。如圖3-E所示，ATO 抑制效應(yīng)并不因cep-1的敲除而改變，表明CEP-1/p53途徑與ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯無關(guān)。

2.4 ATO誘導(dǎo)gld-1(q485)生殖細(xì)胞凋亡

通常認(rèn)為，gld-1(q485)突變因生殖細(xì)胞無法進(jìn)行減數(shù)分裂，因而不能進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致生殖細(xì)胞數(shù)量持續(xù)不受調(diào)控地增加[9]。為進(jìn)一步研究ATO對(duì)gld-1(q485)生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖的抑制機(jī)制，對(duì)ATO處理后生殖細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測(cè)。ATO不僅誘導(dǎo)N2細(xì)胞凋亡，同樣也促進(jìn)了gld-1(q485)生殖細(xì)胞凋亡，并具有顯著的劑量效應(yīng)(圖4-A)。由于gld-1(q485)呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)麻痹表型，因而攝入AO染料的能力較弱。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)gld-1(q485)的特點(diǎn)改進(jìn)了染色的方法，提高了檢測(cè)的靈敏度，AO陽性細(xì)胞分布于生殖腺多個(gè)區(qū)域(圖4-B、C)。這一結(jié)果表明，ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制了gld-1(q485)生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖，延長(zhǎng)了平均壽命。

A：N2線蟲生殖細(xì)胞增殖; B:gld-1(q485)；C：對(duì)照組gld-1(q485)在第4天時(shí)生殖腺遠(yuǎn)端；D：25 μmol/L ATO處理第4天時(shí)gld-1(q485)的生殖腺遠(yuǎn)端；E：敲除gld-1(q485)線蟲cep-1不影響ATO對(duì)生殖細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3ATO處理對(duì)秀麗線蟲有絲分裂生殖細(xì)胞增殖的影響

Figure 3 Effects of ATO treatment on the germ cell proliferation inC.elegans

A：ATO誘導(dǎo)的N2和gld-1(q485)生殖細(xì)胞凋亡；B：對(duì)照狀態(tài)下的gld-1(q485)凋亡細(xì)胞；C：ATO為25.0 μmol/L時(shí)gld-1(q485)的凋亡細(xì)胞。箭頭所指為凋亡細(xì)胞

圖4ATO誘導(dǎo)秀麗線蟲生殖細(xì)胞凋亡

Figure 4 ATO treatment induces germline apoptosisinC.elegans

2.5 CEP-1/p53在ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用

作為眾所周知的腫瘤抑制基因，p53在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。為研究CEP-1/p53是否與ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了攜帶不同CEP-1/p53等位基因的線蟲生殖細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除cep-1(w40)品系外，cep-1(lg12501)和cep-1(gk138)在5.0和10.0 μmol/L ATO劑量下，凋亡細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照均無顯著差異，但當(dāng)ATO升至25.0 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，但顯著低于N2；雖然cep-1(w40)具有殘存的p53活性，但ATO誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)目也顯著低于N2(圖5-A)。為進(jìn)一步分析ATO誘導(dǎo)的gld-1(q485) 細(xì)胞凋亡是否依賴于CEP-1/p53，利用RNAi敲除gld-1(q485)的cep-1基因，結(jié)果表明ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低(圖5-B)。CEP-1/p53在介導(dǎo)ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮雙重效應(yīng)，即在低劑量ATO暴露時(shí)誘導(dǎo)依賴于CEP-1/p53的細(xì)胞凋亡，而在高劑量暴露時(shí)誘發(fā)不依賴于CEP-1/p53的細(xì)胞凋亡。

對(duì)gld-1(q485)線蟲進(jìn)行cep-1 RNAi，并在成蟲后測(cè)定ATO對(duì)生殖腺腫瘤樣增殖的影響，在處理后第4天，敲除cep-1導(dǎo)致生殖腺腫瘤樣增殖比例顯著增加(圖5-C)。這一結(jié)果并不能證明ATO誘導(dǎo)依賴于CEP-1/p53的細(xì)胞周期停滯，與對(duì)照組相比，ATO仍然可以抑制gld-1(q485);cep-1 RNAi生殖腺腫瘤樣增殖(圖5-C)，敲除cep-1導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，但gld-1(q485);cep-1 RNAi生殖細(xì)胞數(shù)目依然增加，呈現(xiàn)出腫瘤樣增殖。

A:CEP-1/p53突變抑制ATO誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡; B:敲除gld-1(q485)的cep-1基因抑制ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡; C:敲除gld-1(q485)的cep-1基因增加了生殖腺腫瘤樣增殖比例

圖5ATO誘導(dǎo)的秀麗線蟲生殖細(xì)胞凋亡依賴于CEP-1/p53途徑

Figure 5 ATO-induced germline apoptosis is dependent on CEP-1/p53 pathway

3 討論

秀麗線蟲gld-1基因編碼的蛋白與人類RNA結(jié)合蛋白QKI同源，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多種機(jī)體活動(dòng)[15]。gld-1突變具有多個(gè)等位基因，其中g(shù)ld-1(q485)和gld-1(op236) 調(diào)節(jié)線蟲生殖細(xì)胞增殖。gld-1(q485)突變因生殖細(xì)胞不受調(diào)控地增殖，只存在低水平生理性細(xì)胞凋亡，因而導(dǎo)致生殖腺腫瘤樣增長(zhǎng)。以該品系作為模型，人們發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子突變可以逆轉(zhuǎn)生殖細(xì)胞的腫瘤樣增長(zhǎng)，其中CEP-1/p53蛋白也發(fā)揮了重要作用[16]，但化學(xué)治療藥物是否可以抑制gld-1(q485)腫瘤樣增殖，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATO延長(zhǎng)了gld-1(q485)品系的平均壽命，抑制了生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖，其作用劑量用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的劑量具有可比性[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATO誘導(dǎo)生殖細(xì)胞停滯和細(xì)胞凋亡是延長(zhǎng)gld-1(q485)突變壽命的關(guān)鍵。由于正常情況下，約有一半的生殖細(xì)胞以細(xì)胞凋亡的形式清除[18]，因此，細(xì)胞凋亡是維持生殖腺穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，對(duì)gld-1(q485)突變而言，ATO誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡是抑制生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖的關(guān)鍵原因。

秀麗線蟲的細(xì)胞凋亡受到多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，如DNA損傷細(xì)胞檢查點(diǎn)基因HUS-1、CEP-1/p53、Caspase-3等[8,18]。由于秀麗線蟲只擁有單個(gè)的p53基因，結(jié)合RNAi技術(shù)，為分析CEP-1/p53基因在ATO抑制生殖腺腫瘤樣增殖機(jī)制提供了有效手段。已有的報(bào)道顯示，三價(jià)砷誘導(dǎo)的秀麗線蟲生殖細(xì)胞凋亡多發(fā)生于減數(shù)分裂區(qū)，并且受到p53、MAPK等途徑調(diào)控[19]。而對(duì)于gld-1(q485)而言，ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡見于生殖腺臂所有區(qū)域。由于RNAi敲除cep-1抑制了ATO誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，ATO誘導(dǎo)的gld-1(q485) 生殖細(xì)胞凋亡依賴于CEP-1/p53，其他與DNA損傷反應(yīng)有關(guān)的基因，如hus-1、ced-3、ced-4、ced-9等是否介入這一過程，尚需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文以具有單一p53基因的秀麗線蟲為對(duì)象，利用攜帶gld-1(q485)突變生殖腺具有腫瘤樣增殖的特點(diǎn)，研究CEP-1/p53是否與ATO抑制的生殖細(xì)胞腫瘤樣增殖有關(guān)。本研究結(jié)果表明，ATO處理延長(zhǎng)了gld-1(q485)品系秀麗線蟲平均壽命，發(fā)揮了類似于ATO治療腫瘤的效應(yīng)，其作用機(jī)制與ATO誘導(dǎo)的不依賴于CEP-1/p53細(xì)胞周期停滯和依賴于CEP-1/p53途徑的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。