海參糖胺聚糖催化自由基降解及其反應動力學研究

張培義

(華測檢測認證集團股份有限公司惠州分公司，廣東 惠州 516083)

海參是棘皮動物門海參綱動物，其具有補腎益精、養(yǎng)血潤燥、溫經通絡等功效。海參體壁內包含酸性粘多糖類物質，其中包括海參糖胺聚糖(簡稱SC-GAG)，其是一種類肝素抗凝劑，具有抗凝血、抑制血小板聚集、防治急性放射性損傷作用，可明顯促進造血功能的恢復和增強。然而，這種從海參中提取的分子量大的糖胺聚糖存在著容易引起血小板聚集等副作用。Toshio I.等[1]的研究結果顯示，低分子量的海參糖胺聚糖比未解聚的多糖在藥效上具有顯著的優(yōu)勢。低分子海參糖胺聚糖由于分子量減小，不容易被細胞外基質、血漿蛋白和細胞受體結合滅活，因此生物利用度更高。此外，低分子海參糖胺聚糖對血小板的影響減小，降低了因影響血小板功能而導致的出血合并癥發(fā)生的可能性。因此，在不改變海參糖胺聚糖基本活性結構的條件下，采取適當的方法制備其低分子量的產物，已引起廣大研究者的高度關注。

有研究者已采用過氧化氫法成功地實現了肝素[2]、海帶硫酸多糖[3]等的降解。Ken-ichiro Y.等[4]首先應用過氧化氫解聚的方法制備得到了低分子海參糖胺聚糖，其研究結果顯示，解聚前后海參糖胺聚糖的化學結構沒有發(fā)生顯著的變化，這證明了該法的可行性。但該法存在著反應時間較長、反應條件苛刻、工藝過程較難控制的缺點，直接給低分子產物的質量穩(wěn)定性帶來了風險。

本文在前人的研究基礎上，把金屬離子催化劑引入反應體系，采用過氧化氫降解法來降解粗海參糖胺聚糖，并針對海參糖胺聚糖的催化自由基解聚過程，結合自由基無規(guī)隨機解聚的過程機制，建立反應動力學模型，并進行試驗驗證。提出帶支鏈巖藻糖的糖胺聚糖的解聚反應機理過程。

1 材料和儀器

1.1 材料

海參糖胺聚糖,自制；

過氧化氫(30%，分析純),天津富宇化工廠

三水合乙酸鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

氯化鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

乙酸鋅(分析純),天津大茂化學試劑廠

乙二胺四乙酸二鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

001×7型強酸性陽離子交換樹脂,南開大學化工廠

1.2 儀器

DL-6M臺式低俗大容量離心機,湘儀離心機；

DZF-6050型真空干燥箱,上海精宏有限公司；

DSK-26型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋,嘉興中新醫(yī)療儀器公司；

高效液相色譜儀Agilent technologies1200 series,Agilent；

切向流超濾儀,Millipore。

2 海參糖胺聚糖的降解反應實驗方法

2.1 實驗原理

過氧化氫氧化降解海參多糖的過程中過氧化氫同金屬離子反應產生羥自由基OHo, 羥自由基OHo帶有一個不成對的電子，性質極為活潑，易攻擊破壞其臨近的海參糖胺聚糖大分子，使其降解。

以某金屬陽離子Mn+為例羥自由基產生過程為[#5]：

Mn++ H2O2→Mn+1++OH·+ OH-

Mn++ OH· →Mn+1++ OH-

Mn+1++ HOO·→Mn++ H++O2

2. 2 實驗過程

分別取5g海參糖胺聚糖，加入200mL水溶解，加入終濃度為0.5mol/L氯化鈉，0.5mol/L三水乙酸鈉，以10mL/h的速度滴加濃度為10%的過氧化氫20 mL，加入1mL濃度為1mol/L的乙酸鋅為催化劑，分別于25，35，45，55℃水浴中反應，反應過程中pH值控制在7.5左右。每組實驗分別于20，40，60，80，100，120min取樣，求得每組不同時間降解產物的分子量，考察催化自由基降解反應動力學。

3 動力學模型的建立

通過對海參糖胺聚糖解聚前后的紅外光譜數據、單糖分析結果以及核磁數據結果的比較分析發(fā)現，支鏈巖藻糖在解聚過程中沒有發(fā)生明顯的脫落，三個單糖的摩爾比也沒有發(fā)生顯著的變化，因此，我們有理由認為海參糖胺聚糖中的β-D-葡萄糖醛酸(1→3)-硫酸酯化-β-D-N-乙酰氨基-半乳糖和硫酸酯化-β-D-N-乙酰氨基-半乳糖(1→4) β-D-葡萄糖醛酸中的糖苷鍵在斷裂的機會上是均等的，并且硫酸酯化-α-L-巖藻糖(1→3)- β-D-葡萄糖醛酸的糖苷鍵不被斷裂。

從而，可以假設海參糖胺聚糖的自由基解聚滿足無規(guī)解聚過程，則定義：

α=s/(N。-1)

(1)

式中：s為因水解而斷裂的鍵數，N。為海參糖胺聚糖的初始聚合度，a為大分子中每一縮醛鍵在某一確定時刻的裂解幾率。假設海參糖胺聚糖降解是單分子反應，則降解速率ds/dt與未斷裂的縮醛鍵數成正比，即：

ds/dt = k(N。- 1- s)

(2)

積分得：

s = (N0-1)[1- exp(-kt)]

(3)

式中：s 與 a 是解聚進行時間為t時的斷鍵數目和降解程度；k為水解速率常數，所以：

a = 1- exp(- kt)

(4)

在時間t時，水解系統(tǒng)的平均聚合度為Nn ，起始聚合度為N。，則：

Nn=N。/(s+1)

(5)

合并式(3)和式(5)，消去s 得：

(Nn-1)/Nn=(N0- 1)/No·exp(-kt)

(6)

等式兩邊分別取對數，則得：

ln[Nn /(Nn - 1)]=-ln[N。/(N。-1)]+kt

(7)

以ln[Nn /(Nn - 1)]對 t 作圖，應為直線關系，直線的斜率為k。根據Arrhenius公式[6]，則有

k=Aexp(-E/RT)

(8)

式中：A 是經驗常數，E是降解反應的表觀活化能，T是熱力學溫度，R是理想氣體常數，兩邊取對數，可以得到：

lnk=lnA-E/RT

(9)

用lnk對-l/RT作圖，即可求出反應的活化能。

4 動力學模型的試驗驗證

根據式(7)以ln[Nn /(Nn - 1)]對t作圖，結果見圖1。由圖2所示，在實驗溫度下，ln[Nn /(Nn - 1)]與 t呈線性關系。

圖1 不同溫度下ln[Nn/(Nn - 1)]與t的關系曲線Fig.1 Relationship curve of ln[Nn/(Nn - 1)] and t in different temperature

圖2 lnk與-1/RT的關系曲線Fig.2 Relationship curve of lnk and -1/RT

對不同溫度下ln[N /(N -1)]-t曲線，進行線性回歸所得直線的斜率即為k值，結果見表1。由表1可見，其回歸系數均在0．989以上，說明在實驗范圍內，糖胺聚糖的降解較好地符合無規(guī)降解過程。此外，隨著溫度的升高，降解的表觀速率常數逐漸增大。

表1 不同溫度下所得k值與R值Tab.1 Result of k and R in different temperature

根據式(9)以lnk對-1/RT作圖，結果見圖2。由圖2中直線的斜率便可得到海參糖胺聚糖降解反應的活化能E為16.47kJ/mol，回歸系數為0．994?；貧w系數較高。因此，通過試驗驗證糖胺聚糖的降解較好地符合無規(guī)降解過程。并在該基礎上求得海參糖胺聚糖降解反應的活化能E為16.47kJ/mol。