小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒的制備及表征

王記蓮

(鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城，224005)

我國(guó)自古以來(lái)就是一個(gè)糧食生產(chǎn)大國(guó)，每年可以生產(chǎn)小麥1.27億t，其中10%用來(lái)制作小麥醇溶蛋白淀粉，小麥醇溶蛋白(gliadin，Gli)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)特殊原因，不能被人體完全利用，有效的部分只占據(jù)了6成。小麥醇溶蛋白疏水氨基酸含量過(guò)高，不溶于水，但是可溶于酒精中[1-2]，利用這一特點(diǎn)，能夠有效制備納米顆粒，使其作為食品活性成分和藥物輸送載體，但因靜電斥力易發(fā)生聚集，影響了應(yīng)用。阿拉伯膠(arabic gum，AG) 是一種具有低蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多支鏈多糖，結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)基本上是鼠李糖及蛋白質(zhì)，如果能通過(guò)靜電的作用與小麥醇溶蛋白結(jié)合，可以提高小麥醇溶蛋白的溶解性[3]。根皮素(phloretin,Phl)是一種黃酮化合物，因其具有特殊的二氫查爾酮結(jié)構(gòu)，使其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫抑制、促進(jìn)骨形成等多種藥理活性[4]。但由于根皮素水溶性小、體內(nèi)吸收低、性質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題限制了它的應(yīng)用。本文將用阿拉伯膠結(jié)合反溶劑法制備負(fù)載根皮素的小麥醇溶蛋白納米顆粒，所得小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒進(jìn)一步對(duì)根皮素進(jìn)行高效負(fù)載，探討了小麥醇溶蛋白的質(zhì)量濃度、醇水體積比以及pH值、鹽粒子強(qiáng)度變化等對(duì)納米顆粒穩(wěn)定性的影響，并對(duì)根皮素的包封率進(jìn)一步的研究，以期提高小麥醇溶蛋白的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥醇溶蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿拉伯膠、根皮素，西安隆茂生物科技有限公司；NaOH、HCl、無(wú)水乙醇等均為分析純，滄州弘祿化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(FD18-QX立式型)、磁力攪拌器、臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(TDZ5B-WS型)，上海博登生物科技有限公司；納米粒度電位儀，馬爾文儀器有限公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV1801)，上海屹譜儀器制造有限公司；低速臺(tái)式離心機(jī)、 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱, 金壇區(qū)金城春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 納米顆粒的制備

參照Z(yǔ)HANG等[5]的方法，稱取1 g Gli溶于10 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中，磁力攪拌30 min，得到質(zhì)量濃度為100 g/L Gli儲(chǔ)備液；稱取一定量AG溶于10 mL去離子水中，500 r/min條件下磁力攪拌1 h得到AG儲(chǔ)備液；量取500 μL Gli儲(chǔ)備液呈細(xì)流狀移至39.0 mL的去離子水中，隨后移取500 μL AG儲(chǔ)備液至去離子水中，磁力攪拌60 min，3 000 r/min離心10 min，取上層清液，即可得到Gli-AG納米顆粒分散液，備用。

1.3.2 Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度變化時(shí)，納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(shù)(polydispersity，PDI)測(cè)定

分別稱取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g Gli溶解于100 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇中，用磁力攪拌器攪拌30 min后得到質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70 g/L的Gli儲(chǔ)備液；按照Gli與AG的質(zhì)量比1∶2來(lái)加入小麥醇溶蛋白、阿拉伯膠，并且調(diào)節(jié)納米顆粒pH值為4，按照步驟1.3.1制成Gli-AG納米顆粒; 稀釋10倍后，利用納米粒度電位儀分別測(cè)定其平均粒徑、ζ-電位及顆粒多分散指數(shù)。

1.3.3 不同醇水體積比下納米顆粒的粒徑、電位、PDI測(cè)定

分別量取Gli儲(chǔ)備液與水按照如下體積比進(jìn)行制備：1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5，設(shè)定納米顆粒體系的pH為4，同時(shí)其他制備過(guò)程與1.3.1相同。

1.3.4 不同pH值下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)樣品pH為3～9。分別取不同pH值納米顆粒1 mL，稀釋10倍，測(cè)定納米顆粒的粒徑、電位及PDI。

1.3.5 不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

取5 mL現(xiàn)制的納米顆粒，分別加入5 mL不同濃度(0～100 mmol/L)的NaCl溶液，攪拌均勻，靜置30 min。分別取1 mL不同NaCl濃度的納米顆粒，稀釋10倍，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 掃描電鏡

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將制備所得的納米顆粒中的乙醇除去后，利用冷凍干燥機(jī)將納米顆粒凍干，即可得到固體樣品。利用導(dǎo)電膠將取出的少量的樣品固定后做噴金處理，探針電壓、電流、電束加速電壓分別為30 kV，45 PA，4.5 kV放大20 000倍。

1.3.7 負(fù)載根皮素的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒的制備

量取800 μL上述1.3.1制備的Gli 儲(chǔ)備液，并加入相應(yīng)體積Phl(按照Gli-AG 與Phl質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)，磁力攪拌30 min以充分溶解得負(fù)載Phl 的Gli 儲(chǔ)備液; 分別移取800 μL 和200 μL 上述1.3.1制備的Phl-Gli儲(chǔ)備液和AG 儲(chǔ)備液至去離子水中(其中Gli 與AG 質(zhì)量比按照前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)比1∶2)，攪拌60 min，3 000 r/min離心15 min后，取上層清液得Phl- Gli-AG 納米顆粒。

1.3.8 不同Phl與Gli-AG質(zhì)量比下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

制取不同的Gli-AG與Phl質(zhì)量比的納米顆粒，量取之前制備好的不同Phl含量的1 mL Gli-AG納米顆粒把它稀釋到原來(lái)的10倍，攪均勻后量取1 mL的樣品放入樣品池內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 根皮素包封率的測(cè)定

參照EBERT等[6]的方法并稍作改動(dòng)，移取10 mL負(fù)載Phl的納米顆粒、10 mL二甲基亞砜置于燒杯中，攪拌1 h，萃取得游離的Phl，用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，重復(fù)萃取3次，合并萃取液用二甲基亞砜稀釋10倍，以二甲基亞砜作為空白對(duì)照，于根皮素特征吸收峰處測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)根皮素在乙醇中標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=0.006 5+0.009x，r=0.999 5，計(jì)算游離根皮素含量，根據(jù)公式(1)得出根皮素包封率：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度對(duì)Gli -AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度對(duì)Gli-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值得影響如圖1所示。隨著Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度的升高，納米顆粒的粒徑在儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為10～50 g/L無(wú)明顯變化，維持在120 nm，PDI 均小于0.3; 當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 g /L 時(shí)，納米顆粒的粒徑和多分散指數(shù)呈現(xiàn)出迅速升高的趨勢(shì)，分別高達(dá)200 nm和0.35左右； 如圖1-b 所示，隨著Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度的升高，電位與粒徑均呈現(xiàn)不穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，即質(zhì)量濃度在10～50 g/L變化時(shí)，電位始終徘徊在-32 mV 左右；當(dāng)Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度大于50 g /L 時(shí)，電位明顯升高，但仍在-25 mV以下， 其主要原因是，當(dāng)Gli儲(chǔ)備液濃度較低時(shí)，分子能夠在水相中充分分散開，整個(gè)體系處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài); 當(dāng)小麥醇溶蛋白濃度過(guò)高時(shí)，小麥醇溶蛋白溶液達(dá)到飽和狀態(tài)，納米顆粒處于穩(wěn)定。由圖1的粒徑、PDI、電位可知，制備Gli-AG納米顆粒時(shí)，應(yīng)選取50 g/L的Gli質(zhì)量濃度為最佳。

a-納米顆粒粒徑和PDI；b-電位圖1 Gli儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位的影響Fig.1 The effect of the different concentrations of Gli in the particle size，PDI，zeta-potential of the Gli nanoparticles

2.2 醇水體積比對(duì)Gli -AG納米顆粒的粒徑、PDI、電位值的影響

如圖2所示，隨著醇水體積比的變化，納米顆粒的粒徑、PDI和電位都沒(méi)有明顯變化，其原因可能是80%的乙醇水溶液能夠?qū)li分子充分溶解，經(jīng)過(guò)液-液的自組裝后，和AG有效結(jié)合在一起。使納米顆粒穩(wěn)定分散在體系中，而且與親水膠體的結(jié)合更有利于提高顆粒在體系中的穩(wěn)定性，最終從經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和提高顆粒的穩(wěn)定性兩方面進(jìn)行綜合考慮，應(yīng)該選擇醇水體積比為1∶50進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a-納米顆粒粒徑和PDI；b-電位圖2 醇水體積比對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位的影響Fig.2 The effect of the different ratio of the ethanol∶water in the particle size，PDI，zeta-potential of the Gli-AG nanoparticles

2.3 pH值對(duì)Gli-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

如圖3所示，隨著pH值的變化，粒徑在140～160 nm無(wú)太大變化; PDI在pH值為3時(shí)略大于0.3，pH值為4～9時(shí)都小于0.3且呈穩(wěn)定狀態(tài)，不同 pH下納米顆粒電位如圖3-b所示，在 pH 值等于3時(shí)，電位為-17.8 mV，相對(duì)較低，可能與pH值為3時(shí)阿拉伯膠的荷電量較低，Gli -AG納米顆粒的電荷減少，電位不穩(wěn)定有關(guān)；當(dāng)電位比較穩(wěn)定時(shí)它的數(shù)值是-30～-40 mV，而此時(shí)的pH值為4～9，Gli-AG納米顆粒狀態(tài)比較穩(wěn)定，此時(shí)小麥醇溶蛋白納米顆粒嚴(yán)重聚集的現(xiàn)象會(huì)有明顯的改變。FRANCESCO等[7]也發(fā)現(xiàn)果膠復(fù)合小麥醇溶蛋白在 pH值為3比較接近果膠的等電點(diǎn)時(shí)電位稍低，穩(wěn)定性很好時(shí)pH值為4～9。

2.4 鹽離子濃度對(duì)納米顆粒的粒徑、PDI、電位值的影響

納米顆粒粒徑、PDI、電位隨鹽離子濃度變化如表1所示，NaCl濃度在0～20 mmol/L時(shí)，粒徑、PDI隨濃度增加逐漸增加，低濃度鹽離子時(shí)納米顆粒體系較為穩(wěn)定；NaCl濃度達(dá)到30 mmol/L時(shí)，分散液的外觀變得混濁，粒徑明顯增加，納米顆粒聚集嚴(yán)重，發(fā)生沉淀。同JOYE等研究結(jié)果相似，高濃度的鹽離子會(huì)中和多糖及蛋白分子表面的大量電荷，降低了Gli與AG之間的靜電作用。

a-納米顆粒粒徑和PDI；b-電位圖3 不同pH值對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響Fig.3 The effect of pH in the particle size，PDI，zeta-potential of the Gli-AG nanoparticles

表1 不同鹽離子濃度對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響Table 1 The effect of PH in the the different concentrations of salt in the particlesize, PDI, zeta-potential of the nanoparticles

注：表中相同字母表示不顯著(P<0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.5 Gli -AG納米顆粒掃描電鏡的結(jié)果

圖4是Gli納米顆粒和Gli-AG納米顆粒電鏡掃描的微觀圖，圖中的Gli-AG納米顆粒為最優(yōu)條件下制備得到的。圖4-a 顯示，未復(fù)合阿拉伯膠的小麥醇溶蛋白納米顆粒大小不一樣，部分顆粒之間有聚集現(xiàn)象的存在，其主要原因可能是因?yàn)镚li納米顆粒的復(fù)溶性不太好; 圖4-b顯示Gli-AG納米顆粒呈現(xiàn)圓形，大小一樣，該結(jié)果與惠曉麗等[8]的研究結(jié)果相同； 且阿拉伯膠、小麥醇溶蛋白沒(méi)有分離，通過(guò)比較來(lái)看與賈峰等[9]研究的果膠復(fù)合Gli納米顆粒掃描電鏡圖的結(jié)果一致。

a-Gli納米顆粒；b-Gli-AG納米顆粒圖4 納米顆粒掃描電鏡圖Fig.4 The SEM of the nanoparticles

2.6 Gli-AG與Phl質(zhì)量比對(duì)納米顆粒負(fù)載根皮素的粒徑、PDI、電位值

由圖5可知，隨著根皮素負(fù)載量的增大，納米顆粒的粒徑也相應(yīng)增高，當(dāng)質(zhì)量比在1∶5 以下時(shí)，納米顆粒粒徑和PDI值相對(duì)穩(wěn)定，這時(shí)根皮素就與納米顆粒完全結(jié)合，當(dāng)Gli與Phl的質(zhì)量比為1∶5時(shí)，粒徑是180.4 nm，PDI是0.3，當(dāng)質(zhì)量比大于1∶5時(shí)，納米顆粒達(dá)到200 nm時(shí)，同樣PDI也大于0.3。如圖5-b所示，Gli納米顆粒與Phl的質(zhì)量比變小時(shí)，相對(duì)應(yīng)的電位也會(huì)跟著下降，當(dāng)大于1∶5時(shí)，電位雖然下降，但是變化不明顯，數(shù)據(jù)在30 mV左右，此實(shí)驗(yàn)與許雪兒等[10]研究的結(jié)果是一致的。綜上所述，Gli-AG與Phl 質(zhì)量比1∶5時(shí)從粒徑、PDI、電位的對(duì)比圖來(lái)看，納米顆粒的穩(wěn)定性較強(qiáng)，且包封率高，達(dá)到Gli大分子高效負(fù)載根皮素的目的。

a-納米顆粒粒徑與PDI；b-電位圖5 Gli/AG與Phl質(zhì)量比對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響Fig.5 The effect of Gli/AG∶Phl in the particlesize，PDI，zeta-potential of the nanoparticles

2.7 Gli -AG納米顆粒負(fù)載Phl包封率

由表2 可以看出，納米顆粒包封率隨著Gli-AG納米顆粒負(fù)載Phl含量增大而逐漸增大，但是負(fù)載Phl比例不同時(shí)，變化趨勢(shì)稍有不同，當(dāng)Gli-AG與Phl質(zhì)量比小于1∶5時(shí)，包封率增大的趨勢(shì)不明顯，究其原因，可能是因?yàn)轶w系中Phl的含量較小，能全部被Gli-AG結(jié)合，所以負(fù)載能力相對(duì)較強(qiáng); 而當(dāng)Gli-AG與Phl的質(zhì)量比大于1∶5 時(shí)，Phl包封率下降趨勢(shì)比較明顯，主要是因?yàn)轶w系中過(guò)高的Phl比例反而會(huì)降低其負(fù)載能力。Gli-AG與Phl的質(zhì)量比為1∶5時(shí)，包封率達(dá)到 88.9%。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化Gli儲(chǔ)備液濃度制備Gli-AG載體，考察Phl與Gli-AG質(zhì)量比、pH、鹽離子濃度對(duì)運(yùn)載體系穩(wěn)定性的影響，得到優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件為Gli儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為50 g/L，醇水體積比1∶50，Gli與AG的質(zhì)量比為1∶2， pH值為4～9，鹽離子濃度不大于20 mmol/L。在此優(yōu)化條件下，當(dāng)納米顆粒與根皮素質(zhì)量比為1∶5時(shí)，制備得到的Gli-AG納米顆粒負(fù)載Phl，包封率達(dá)到接近90%。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合AG的Gli納米顆粒的穩(wěn)定性增強(qiáng)，耐鹽耐酸堿性強(qiáng)，可作為根皮素的有效輸送載體，改善其生物活性利用度。

表2 不同Gli-AG與Phl質(zhì)量比納米顆粒對(duì)根皮素的包封率的影響Table 2 The effect of Gli-AG: Phl of the encapsulation efficiency of Phl