氧化條件下HL-低鈉鹽對鵝肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

張建華，夏楊毅,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

鵝肉是一種典型的綠色禽類食品，是一種低脂肪、低膽固醇的健康食品，肉中的必需氨基酸含量與成人必需氨基酸平均需要量非常接近，所以鵝肉蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)完全蛋白質(zhì)，且其蛋白含量高達22.3%，是畜禽肉中蛋白含量較高的一種[1]。肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)作為鵝肉蛋白中的主要成分對肉蛋白的凝膠特性起主要作用，同時與肉制品的質(zhì)構(gòu)、保水性及感官品質(zhì)等性質(zhì)密切相關[2]。畜禽經(jīng)屠宰后，其肌肉組織的載體蛋白中過渡金屬的釋放和抗氧化系統(tǒng)的減弱都會導致活性氧的形成[3]，這些活性氧會造成蛋白質(zhì)氧化[4]。蛋白氧化的程度不同對于肉類的影響不同，適度的蛋白氧化有利于促進和改善蛋白的凝膠性和乳化性，過度的蛋白氧化則會降低凝膠強度，影響肉類的品質(zhì)。

NaCl通常用于在肉類加工中溶解MP。通常，需要2%～3%(0.47～0.68 mol/L)的NaCl來溶解MP并充分發(fā)揮其功能。然而，高鹽食品的攝入會導致鈉攝入過量，進而增加易感鹽個體的血壓[5]，從而提高了心血管疾病及腎臟疾病的風險[6-7]，因此低鈉食品已經(jīng)引起了學者及企業(yè)的廣泛關注，但是 NaCl含量的降低將導致蛋白質(zhì)的不完全溶解，這可能導致肉制品品質(zhì)的惡化。而近年來氨基酸作為一類鹽替代的成分，已逐步進入人們的研究范疇。ZHANG等得出L-賴氨酸(L-lys)，L-組氨酸(L-His)和L-精氨酸(L-Arg)能夠通過組分之間的相互作用促成NaCl的咸味[8]。GUO等的研究發(fā)現(xiàn)L-Lys和L-His能夠引起二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化并增加肌球蛋白的溶解度[9]。HAYAKAWA等的研究進一步證實L-組氨酸對肌球蛋白凝膠特性有顯著影響[10]。在郭秀云的研究中，通過仿生學原理，采用配方均勻設計實驗，開發(fā)出了一種新型的HL-低鈉鹽，其配方(質(zhì)量分數(shù))為：NaCl 42.8%，KCl 45.2%, 葡萄糖酸鈉 3.5%,L-組氨酸 1.5%，L-賴氨酸7.0%[11]，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)HL-低鈉鹽比單獨使用L-賴氨酸或L-組氨酸更有利于肌球蛋白功能特性及凝膠特性的提升。目前這一配方已用于金華火腿及肉制品中，研究發(fā)現(xiàn)這一配方在降低鈉含量的同時，能夠較好地保持甚至改善產(chǎn)品的品質(zhì)[12-13]。但目前對于HL-低鈉鹽的用量用于MP的影響還沒有報道。因此，本研究以鵝肉MP為原料，分別以不同的NaCL添加比例(高鹽、生理鹽、低鹽)為對照，探究不同添加比例的HL-低鈉鹽對經(jīng)Fenton氧化體系加速氧化后24、48及72 h后MP凝膠特性的影響，進而初步探索HL-低鈉鹽對氧化MP凝膠的影響及機理，為HL-低鈉鹽用于MP凝膠的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：新鮮白條鵝(120 d日齡)，購于浙江省紹興市天天肉食品有限公司，將活鵝宰殺后進行清洗冷凍，并在運輸過程中將鵝肉置于裝有冰袋的保溫箱中，以減少外界溫度對原料肉品質(zhì)的影響。鵝肉解凍后，將其鵝肉剔出來，封口包裝，放于-20 ℃的冰箱內(nèi)，用之前將鵝肉置于4 ℃的冰箱中解凍。

試劑：NaCl(99.5%)、KCl(99.19%)、葡萄糖酸鈉(99.4%)，美國Two Poles Metallic Compound Co.,Ltd公司；L-賴氨酸(99.2%)、L-組氨酸(99%)，美國Double Speed Amino Acid Corporation公司；

HL-低鈉鹽的配制(質(zhì)量分數(shù))：NaCl 42.8%，KCl 45.2%, 葡萄糖酸鈉 3.5%,L-組氨酸 1.5%，L-賴氨酸7.0%。Feton 氧化體系的配制：10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L 抗壞血酸，1 mmol/L H2O2。

1.2 儀器與設備

5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；TA. XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；MCR302模塊化旋轉(zhuǎn)與界面流變儀，德國Anton公司；SYNERGYH1MG全波長酶標儀，美國基因公司；冰箱，BCD-649WE，青島海爾股份有限公司；TGL-16醫(yī)用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；FSH-Ⅱ高速電動勻漿器，江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠。HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[14]和XIONG[15]的方法略作修改，鵝肉于0～4 ℃解凍后，去除脂肪、淤血及結(jié)締組織并攪碎，加入4倍體積的緩沖液A(0.15 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)進行提取，以滅菌、晾干后的紗布過濾以除去多余的筋腱結(jié)締組織，冰水浴勻漿60 s(10 000 r/min)，再離心30 min(4 ℃，8 000×g)，重復離心操作3次，收集沉淀物，即MP粗體物。之后將沉淀物分散在4倍體積的冰浴混合液B(0.15 mol/L NaCl溶液，1 mmol/L NaN3，pH 7.0)中，冰水浴勻漿60 s(10 000 r/min)，離心20 min(4 ℃，8 000×g)，重復操作2次，收集沉淀物，之后加入8倍體積的緩沖液B(pH 6.25)，勻漿后用4層紗布過濾，之后再進行離心(4 ℃，9 000×g，20 min)，所得沉淀即為純的MP。所得沉淀再次分散在4倍體積的去離子水中進行洗脫2次，離心10 min(4 ℃，9 000×g)，取沉淀，即為不含食鹽的MP。以牛血清蛋白作標準曲線，雙縮脈法測定蛋白質(zhì)濃度，并將MP放置于4 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)用完。

1.3.2 不同濃度的NaCl和HL-低鈉鹽處理MP

參照TAKAI等[16]方法，稍作改動。取上述MP分散于氧化體系中(pH6.0，含有0.5 mol/L KCl，10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L 抗壞血酸，1 mmol/L H2O2溶液中)，勻漿30 s(4 500 r/min)，配制成40 mg/mL的蛋白溶液，分成8組，分別向其中加入質(zhì)量分數(shù)0.1%、1%、3.5%的NaCl和質(zhì)量分數(shù)0.1%、1%、1.5%、2.5%、3.5%的HL-低鈉鹽，緩慢攪拌(盡量避免產(chǎn)生泡沫)，在4 ℃冰箱中靜置反應，分別于反應結(jié)束后的24、48、72 h用1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)終止反應，之后進行指標的測定。

1.3.3 凝膠的制備

參考付淵[17]的方法，將上述處理組的MP溶液分別裝入小燒杯(θ 27 mm×35 mm)，置于25 ℃水浴鍋中，以2 ℃/min的升溫速率加熱至40 ℃，恒溫處理30 min，再以2 ℃/min的升溫速率加熱至80 ℃，恒溫處理30 min，取出小燒杯放入冰水浴中冷卻20 min，放入4 ℃冰箱中過夜(約12 h)，待用。

1.4 指標測定

1.4.1 凝膠強度的測定

參照徐幸蓮[18]等的方法，稍作改動。將蛋白凝膠從冰箱中取出，室溫下放置30 min，采用型號為TA-XT Plus的質(zhì)構(gòu)儀，程序設定采用TPA，觸發(fā)類型為Stain，探頭采用P/0.5。探頭下壓過程中，測前速度定為2 mm/s，測中速度定為1.0 mm/s，測后速度定為1.0 mm/s，觸發(fā)力定為5 g，下壓距離為4 mm(變性率為40%)，數(shù)據(jù)提取率為200 pps，停留時間為5 s，凝膠強度單位為g，試驗重復3次。

1.4.2 凝膠蒸煮損失率的測定

稱量加熱前離心管的質(zhì)量W(g)、離心管和鵝肉MP的總質(zhì)量W1(g)，加熱后除去水分稱總質(zhì)量W2(g)，鵝肉MP的加熱損失按公式(1)計算：

(1)

1.4.3 凝膠保水性的測定

參照MA[19]的方法，并作適當修改。將已稱重的MP凝膠置于規(guī)格為40ml的離心管中(θ=25mm)于4 ℃環(huán)境下，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心后，取出離心管，用濾紙吸去多余可見的水分，稱重。試驗重復3次。保水性(WHC)的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：M0，空離心管的質(zhì)量，g；M1，離心前離心管和MP凝膠的總質(zhì)量，g；M2，離心后離心管和MP凝膠的總質(zhì)量，g。

1.4.4 凝膠相互作用力的測定

1.4.5 凝膠流變性質(zhì)的測定

動力流變學試驗通過測定儲能模量(G′)，可以闡明蛋白質(zhì)凝膠和蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的機理。將提取的MP溶解在含0.5 mol/L KCl的氧化體系中，配制成 40 mg/mL的溶液，在反應結(jié)束后的24、48、72 h進行處理。在動態(tài)流變儀中使用直徑為60 mm的平行板，平行板間的空隙選1 mm，在25～80 ℃進行溫度掃描，并在80℃下保溫10 min，加熱速率為1 ℃/min，振蕩頻率為1 Hz，應力振幅為0.01。記錄溫度掃描過程中彈性模量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠強度的影響

凝膠強度的高低反映MP與水結(jié)合的程度，同時與肉制品的質(zhì)構(gòu)特性密切相關。凝膠強度的高低與凝膠的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和氫鍵鍵能的強弱有關[21]。由圖1可知，隨著氧化周期的延長，MP的凝膠強度顯著降低(P<0.05)，這是由于氧化破壞蛋白結(jié)構(gòu)，使得疏水基團暴露，導致蛋白無法與水形成穩(wěn)定致密的結(jié)構(gòu)，進而降低了蛋白質(zhì)的凝膠強度[22]。同時氧化使得凝膠形成疏松多孔的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，且隨著氧化時間的延長，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)減少，而大小不一的蛋白聚集膠束增加，好似變性蛋白顆粒的聚集體，而這在宏觀上表現(xiàn)為凝膠強度的降低[23]。DECKER等在研究經(jīng)自由基氧化體系處理后的火雞肉MP的凝膠強度時，也得出一致的結(jié)論[24]。在同一個氧化周期內(nèi)，MP的凝膠強度隨著NaCl添加比例的升高而顯著增強(P<0.05)，這是由于Cl-的電負性較強，易和氨基酸側(cè)鏈的—NH2結(jié)合，且N—H—Cl的鍵能強于N—H—H的氫鍵鍵能。而隨著HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP的凝膠強度顯著升高(P<0.05)，當HL-低鈉鹽的添加比例達到2.5%時，其MP凝膠強度和3.5%的NaCl處理組的凝膠強度差異不顯著(P>0.05)，這可能與HL-低鈉鹽對蛋白氧化的抑制程度有關[23]。

圖1 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠強度的影響Fig.1 Effect of different salt substitutions on gel strength of goose muscle fibrillin注：A～C表示不同氧化周期之間差異顯著，a～g表示在同一周期內(nèi)不同處理組之間差異顯著,且由A→C、由a→g依次減小(下同)

2.2 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠蒸煮損失率的影響

凝膠的蒸煮損失率可以用來評估凝膠的持水能力。由圖2可知，隨著氧化周期的延長，MP凝膠的蒸煮損失率顯著升高(P<0.05)，這是由于氧化導致蛋白結(jié)構(gòu)破壞，進而使得MP在空間結(jié)構(gòu)上對水分子的保留能力減弱[25]。同時氧化使得凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)疏松甚至被破壞，加大水分等的流出，因此蒸煮損失率增大[26]。在同一個氧化周期內(nèi)，隨著NaCl添加比例的升高，MP凝膠的蒸煮損失率顯著降低(P<0.05)，這是由于NaCl 對鹽溶性蛋白的溶出作用，進而利于形成結(jié)構(gòu)均勻細致的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，增強了對水分的束縛作用，減少蒸煮損失[27]。而隨著HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP凝膠的蒸煮損失率顯著降低(P<0.05)，氧化24 h后，2.5%HL-低鈉鹽處理組的MP凝膠的蒸煮損失率和3.5% NaCl處理組的MP凝膠的蒸煮損失率差異不顯著(P>0.05)，而氧化48 h和72 h后，2.5%HL-低鈉鹽處理組的MP凝膠的蒸煮損失率顯著低于3.5% NaCl處理組的MP凝膠的蒸煮損失率(P<0.05)，說明HL-低鈉鹽處對于MP凝膠蒸煮損失的抑制作用隨著氧化周期的延長而逐漸顯著。

圖2 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠蒸煮損失率的影響Fig.2 Effect of different salt substitutions on the cooking loss rate of goose muscle fibrillin gel

2.3 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠保水性的影響

凝膠保水性是凝膠最重要的品質(zhì)之一，其與凝膠強度及凝膠結(jié)構(gòu)等密切相關[28]。由圖3可知，隨著氧化周期的延長，MP凝膠的保水性顯著降低(P<0.05)，LI等[26]指出羥基自由基引起的氧化將導致結(jié)合水部分轉(zhuǎn)移為游離水，從而降低了MP凝膠的保水性，增大MP凝膠的蒸煮損失率，這與2.2的結(jié)論一致。在同一個氧化周期內(nèi)，MP凝膠的保水性隨著NaCl添加比例的升高而顯著升高(P<0.05)，這與NaCl有利于形成結(jié)構(gòu)均勻細致的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)有關[29]。隨著HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP凝膠的保水性顯著升高(P<0.05)，氧化24 h后，3.5% HL-低鈉鹽處理組的MP凝膠的保水性和3.5% NaCl處理組的MP凝膠的保水性差異不顯著(P>0.05)，而氧化48和72 h后，2.5%HL-低鈉鹽處理組的MP凝膠的保水性顯著高于3.5% NaCl處理組的MP凝膠的保水性(P<0.05)，說明HL-低鈉鹽對于MP凝膠保水性的保護作用隨著氧化周期的延長而顯著增強。而LI等[25]指出凝膠中的含水量越高，凝膠的強度越高，這與2.1的結(jié)論一致。

圖3 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠保水性的影響Fig.3 Effect of different salt substitutions on water retention of goose muscle fibrillin gel

2.4 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠化學作用力的影響

化學作用力是維持MP構(gòu)象穩(wěn)定性的重要指標。

凝膠的化學作用力與凝膠的強度、保水性、蒸煮損失率及MP的羰基含量、巰基含量、表面疏水性等性質(zhì)密切相關。由圖4可知，在MP凝膠中化學作用力由強到弱依次為：疏水相互作用>二硫鍵>氫鍵>離子鍵，且疏水相互作用和二硫鍵的貢獻遠大于離子鍵和氫鍵，說明在MP凝膠中維持構(gòu)象穩(wěn)定性的主要作用力是疏水相互作用和二硫鍵。隨著氧化周期的延長，MP凝膠中的離子鍵、氫鍵和二硫鍵含量顯著降低(P<0.05)，而疏水相互作用的含量顯著升高(P<0.05)，這是由于氧化降低蛋白表面的凈電荷數(shù)，進而降低離子鍵的含量[30]，同時由于自由基對于氨基酸側(cè)鏈的攻擊，進而降低了氫鍵的含量[21]，而二硫鍵含量的降低可能是由于蛋白巰基被氧化成為不可逆氧化狀態(tài)，形成了非二硫鍵的含硫化合物[31]，同時氧化能夠增強蛋白的表面疏水性，進而引起疏水相互作用的增強[32]。在同一個氧化周期內(nèi)，隨著NaCl和HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP凝膠的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵含量呈上升趨勢，而離子鍵呈下降趨勢。而研究表明疏水相互作用、二硫鍵和氫鍵含量的升高都有利于維持凝膠的三維結(jié)構(gòu)，進而有利于凝膠的品質(zhì)形成[33-35]，這與本文中2.1、2.2及2.3的結(jié)論一致。

a-離子鍵；b-氫鍵；c-疏水相互作用；d-二硫鍵圖4 不同鹽替代對鵝肉MP凝膠化學作用力的影響Fig.4 Effect of different salt substitutions on chemical force of goose muscle fibrillin gel

2.5 不同鹽替代對鵝肉MP升溫間斷彈性模量的影響

彈性模量(G′)是描述蛋白形成凝膠的重要指標，目前已廣泛用于研究MP的熱誘導凝膠化，其與凝膠強度和保水性等性質(zhì)密切相關[36]。由圖5可知，隨加熱溫度的升高，MP凝膠的流變特性符合一般蛋白流變特性的規(guī)律，即處理組的MP在45～50 ℃時出現(xiàn)第1個峰值，隨后下降，當溫度超過55 ℃后又開始逐步上升達至第2個峰值[37]。隨著氧化周期的延長，MP凝膠的彈性模量顯著降低，氧化24、48、72 h后，MP凝膠的彈性模量范圍依次在132～202 Pa、107～184 Pa、61～112 Pa。這是由于蛋白氧化導致蛋白變性，且隨著氧化時間的延長，蛋白變性程度增強，進而導致更大的破壞作用，引起蛋白結(jié)構(gòu)及蛋白分子間和分子內(nèi)作用力的變化[38]，這也同本實驗中凝膠強度、凝膠保水性及凝膠二硫鍵含量的變化是一致的。且隨著氧化周期的延長，MP形成凝膠溫度降低，氧化24、48、72 h后，MP形成凝膠的溫度依次為75.11～77.12、71.12～73.12、69.13～71.13 ℃。這與崔旭海的研究結(jié)果一致[38]。在同一個氧化周期內(nèi)，隨著NaCl添加比例的升高，MP凝膠最終的彈性模量值逐漸升高，這是由于NaCl能夠增強MP溶解度，進而增強蛋白分子間的相互吸引作用，從而形成了穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[39]，而隨著HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP凝膠最終的彈性模量值逐漸升高，說明HL-低鈉鹽促進了MP凝膠的形成并提高了其凝膠性能，這與本文中2.1、2.2、2.3的結(jié)論一致。

a-氧化24 h；b-氧化48 h；c-氧化72 h圖6 不同鹽替代對鵝肉MP升溫間斷彈性模量的影響Fig.6 Effect of different salt substitutions on the intermittent elastic modulus of goose myofibrillar protein

3 結(jié)論

本實驗以經(jīng)Fenton氧化體系加速氧化后的鵝肉MP為基礎，以質(zhì)量分數(shù)0.1%、1%和3.5%的NaCl添加組對照，探究了不同添加比例的HL-低鈉鹽處理組對MP凝膠特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)由于蛋白氧化對蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，引起蛋白分子間和分子內(nèi)的化學鍵斷裂，以及疏水基團的暴露，進而導致MP凝膠特性發(fā)生變化。隨著氧化周期的延長，MP凝膠中的離子鍵、氫鍵和二硫鍵的含量顯著降低(P<0.05)，而疏水相互作用顯著升高(P<0.05)，同時MP凝膠的彈性模量顯著降低(P<0.05)，且形成凝膠的溫度降低，而這些變化導致了凝膠強度和凝膠保水性的顯著降低(P<0.05)，凝膠蒸煮損失率顯著升高(P<0.05)。在同一個氧化周期內(nèi)，隨著NaCl添加比例和HL-低鈉鹽添加比例的升高，MP凝膠中的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的含量呈上升趨勢，而離子鍵的含量呈下降趨勢，同時MP凝膠的彈性模量顯著升高，進而導致MP凝膠的強度和保水性顯著升高(P<0.05)，而凝膠的蒸煮損失率顯著降低(P<0.05)，且當HL-低鈉鹽的添加比例達到2.5%時，MP的凝膠特性和3.5%的NaCl處理組的凝膠特性差異不顯著或部分性質(zhì)顯著優(yōu)于3.5%NaCl處理組的凝膠特性。由于本實驗只研究了Fenton氧化體系中HL-低鈉鹽對MP凝膠特性的影響，所以對在其他氧化體系中或是自然氧化狀態(tài)下HL-低鈉鹽對MP的特性影響有待進一步深入。