吳仕達,張玉斌*,邰晶晶,魏紅艷,雷蕓,余群力
1(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)2(浙江工商大學 食品與生物工程學院,浙江 杭州,310000) 3(蘭州文理學院 化工學院,甘肅 蘭州,730070)
肉色是消費者用以判斷鮮肉貨架期和可接受性非常重要的指標[1],因此在冷鮮肉有氧貯藏過程中維持肉色穩(wěn)定尤為重要[2]。近年來有學者研究驗證了通過注射增強技術(shù)在肉中加入乳酸鹽,可穩(wěn)定肉的色澤[3]。目前,市場上冷卻肉的主要包裝形式有真空包裝、托盤透氧包裝和高氧氣調(diào)包裝[4],其中阻氣性非常重要,因此塑料薄膜是肉類產(chǎn)品在零售期間的首選材料[5]。大多數(shù)肉品包裝材料都是用聚乙烯(polyethylene,PE)、聚丙烯(polyropylene,PP)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)制得,其中聚酰胺/聚乙烯(polymide polythyene,PA/PE)薄膜應用最為廣泛。這些聚合物的優(yōu)點包括容易實現(xiàn)機械化生產(chǎn),生產(chǎn)成本低,同時這些聚合物還具有優(yōu)良的阻隔性和熱封性等特點。由于考慮到石油化學塑料包裝材料的不可再生性與不可降解性,對環(huán)境的不利因素已成為影響這些聚合物材料發(fā)展的重要障礙,人們開始關(guān)注塑料包裝材料的替代品[6],開發(fā)生物可降解材料來替代塑料包裝材料,從而實現(xiàn)真正的綠色經(jīng)濟、綠色生產(chǎn),解決環(huán)境可持續(xù)問題有為重要[7]。目前,可生物降解塑料聚乳酸(polylactic acid,PLA)是大眾認為最具潛力的生物降解材料,因為具有的良好熱塑性、可生物降解性、生物相容、高模量和良好的加工性[8]。PLA是線性脂肪族熱塑性聚酯,通過乳酸的縮聚或通過乳液的縮聚產(chǎn)生丙交酯開環(huán)聚合,它可通過玉米、纖維素和其他多糖等再生農(nóng)業(yè)來源的物質(zhì)發(fā)酵合成[9]。而限制PLA材料大規(guī)模應用的重要因素是其阻氣性相對較差[10],通常需添加增塑劑以增加其柔韌性和阻氣性[11]。近年來一些學者對PLA進行了改性處理,將PLA與其他柔性聚合物如聚己內(nèi)酯(polycaprolactone, PCL)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(plybuyladpate terepthalate,PBAT)進行改性研究。其中PBAT是一種脂肪族芳香共聚酯,可完全生物降解,具有優(yōu)良的延展性、斷裂伸長率、熱量阻力和抗沖擊性,因此PBAT被認為是一種良好的韌性材料候選者[12]。李月明等[13]研究表明了PBAT和碳酸鈣混合可以實現(xiàn)材料的快速降解,這大大節(jié)省了成本。劉燕等[14]對PLA、聚甲基乙撐碳酸酯(polymethylethylene carbonate, PPC)、PBAT三種材料共混制得的生物可降解復合膜的阻隔性和延伸性進行研究,發(fā)現(xiàn)其阻隔性能優(yōu)于PA/PE薄膜。ALITRY等[15]研究了PLA和PBAT兩種材料共混制得的生物可降解復合膜的機械特性和形態(tài)特性,發(fā)現(xiàn)其韌性和封口性優(yōu)于PLA薄膜。
藏羊?qū)儆诰d羊三大品種之一,分布區(qū)域集中分布于我國的青藏高原地區(qū)[16],由于生長在高海拔低氧環(huán)境下,藏羊肉色因其較高的肌紅蛋白含量而呈深紅色。肉色作為最直觀的品質(zhì)指標,是消費者判斷肉品質(zhì)的重要標準[17]。伴隨著肉的貨架期延長和后續(xù)加工處理,肉色穩(wěn)定性變差、商業(yè)價格降低等現(xiàn)象是導致藏羊肉及其產(chǎn)品在市場上不易被消費者接受的重要原因。因此本實驗以藏羊肉后腿肉為原料,結(jié)合乳酸鹽注射增強技術(shù),通過綜合對比分析PLA/PBAT可降解薄膜、PA/PE薄膜2種不同包裝材料對藏羊肉色穩(wěn)定性的影響,探討其對肉色穩(wěn)定性的作用及對高鐵肌紅蛋白還原酶(methemglobin reductase,MMbR)活力的影響,以期為延緩宰后生鮮藏羊肉肉色劣變提供理論依據(jù),為不同包裝材料在肉及肉制品的實際應用提供理論參考。
新鮮藏羊后腿肉,采自甘肅臨夏安多有限公司,離體后采取嚴格避光、隔絕空氣和低溫運輸條件下送入實驗室。除去表皮脂肪和筋膜,切成50 g左右薄厚相同的肉塊,注射0.3%(質(zhì)量分數(shù))的乳酸鈣,添加量為肉質(zhì)量的5%。包裝處理后貯藏在(4±1) ℃條件下,分別在成熟的1、3、5、7 d測定相應指標。
聚酰胺/聚乙烯(PA/PE)包裝袋,鄭州博利達包裝有限公司;聚乳酸復合包裝材料(PLA/PBAT),江蘇天仁生物材料有限公司(表1)。
表1 包裝材料參數(shù)Table 1 Packaging material parameters
食品級乳酸鈣,鄭州凱之裕食品添加劑有限公司;亞鐵氰化鉀(分析純)、Tris,天津市光復科技發(fā)展有限公司;NADH(分析純),邦泰生物工程有限公司。
Konica CR-10色差計,珠海天創(chuàng)儀器有限公司;JY96-N高速分散器,廣州格丹納儀器有限公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機,上海沛歐分析儀器公司;SP-756P紫外可見光分光光度計,貝克曼有限公司;PHS-3C電子天平,沃特世有限公司;CN10-JY92-2DA超聲波細胞破碎機,托摩根生物技術(shù)有限公司。
1.4.1 色度值的測定
肉色采用CR-410色差計測定,CIE Lab均勻顏色空間分為L*值(亮度)、a*值(紅色度)和b*值(黃色度)。將色差計測量孔對準確定待測肉表面并壓緊,按下“測量”按鈕,讀取L*、a*、b*值。分別測定在1、3、5、7 d的L*、a*、b*值,每塊肉取3個點進行測量,取平均值。
1.4.2 總色素的測定
參考KRZYWICKI的方法并略有改進[18]。準確稱取5.0 g肉樣,加入pH 6.8、0.04 mol/L 20 mL的緩沖液,勻漿后靜置1 h,以3 300 r/min離心30 min,過濾,后用同樣的緩沖液定容,在572、565、545、525 nm處測定其吸光度值。氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin,OMb)和高鐵肌紅蛋白(methemoglobin,MMb)含量的計算公式如公式(1)和公式(2)所示:
OMb含量/%=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100
(1)
MMb含量/%=(-2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100
(2)
式中:R1、R2、R3分別是吸光率比值A(chǔ)572/A525、A565/A525、A545/A525。
1.4.3 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)濃度的測定
采用來自科銘生物有限公司的試劑盒,操作流程如下:準確稱取0.1 g的肉樣,離心力為600×g的條件下離心5 min,過濾上清液,在1 100×g的條件下離心10 min,取沉淀,按照說明加入相應試劑,超聲波進行破碎,功率為20%,超聲時間為3 s,間隔10 s,重復25次,所有的操作都在4 ℃下完成。在600 nm處以蒸餾水調(diào)零,按照操作說明加入相應試劑,最后測定其在20 s和80 s處的吸光度值,并計算。
1.4.4 高鐵肌紅蛋白還原酶(methemoglobin reductase,,MMbR)活力的測定
(1)粗酶液的制備
參照REDDY等的方法并略有改進[19]。取肉樣10.0 g,加入2.0 mmol/L,pH 7.0的磷酸緩沖液20 mL,冰浴勻漿2 min,均質(zhì)2 min,在10 000 r/min的條件下離心20 min,用中性定性濾紙過濾得到上清液,上清液用鐵氰化鉀氧化后,用緩沖液進行透析,時間為24 h,期間要換液5次,透析后在12 000 r/min的條件下離心20 min,并用相同緩沖液定容20 mL,貯存在-80 ℃條件下備用。
(2)高鐵肌紅蛋白標準液的制備
用2.0 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液溶解肌紅蛋白標品,并加入鐵氰化鉀進行氧化,在4 ℃下先用蒸餾水透析,后用相同緩沖液透析使其高鐵肌紅蛋白的濃度縮至0.75 mmol/L。將制備好的高鐵肌紅蛋白溶液在50 ℃下水浴加熱5 min,過程中要防止高鐵肌紅蛋白酶失去活性。
(3)MMbR活力的測定
配制MMbR反應體系,成分如表2所示。
表2 高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定的反應組分Table 2 Reaction substances of yak meat metmyoglobin reductase activity
注:a為50 ℃水浴,保溫10 min,重復樣本(平行樣)∶n=3
1.4.5 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogense,LDH)活性的測定
采用來自科銘生物有限公司的試劑盒,操作步驟如下:準確稱取0.5 g肉樣,加入5 mL的提取液,冰浴勻漿,后在離心力為8 000×g的條件下離心10 min,按照操作說明順序加入相應試劑,在室溫下靜置3 min,在450 nm處測定其吸光度值并計算。
1.4.6 線粒體膜電位的測定
線粒體膜電位的測定使用試劑盒,其操作步驟如下:
(1)工作液的配制:每50~100萬個細胞懸浮需要0.5 mL JC-1染色溶液,JC-1染色溶液的配制參考操作說明進行。
(2)線粒體膜電位的測定:用熒光光譜儀直接混合掃描,按照說明書進行參數(shù)設(shè)定進行測定。
1.4.7 線粒體膜通透性的測定
參考LANARI等方法并略有改進[20]。首先稱取剔除脂肪和筋膜的肌肉組織10.0 g,用250 mmol/L蔗糖洗滌組織2次并懸浮于60 mL線粒體分離緩沖液中(250 mmol/L 蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA,pH 7.4),勻漿,使其pH保持在7.0~7.2。后用線粒體分離緩沖液將懸浮液稀釋至300 mL,以900×g的離心力離心20 min,得到的上清液再次在14 000×g條件下離心15 min,最后將線粒體沉淀洗滌2次懸浮于線粒體懸浮緩沖液(250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4)中,所有步驟均在0~4 ℃下進行。
參照HALSTRAP等方法并略有改進[21]。在520 nm(A520)處測量其吸光度值,并且根據(jù)A520改變表示線粒體膜通透性的變化。如果溶液的吸光度值A(chǔ)520降低,說明線粒體膜的滲透性增加;若吸光度值A(chǔ)520增加,則線粒體膜通透性降低。
本試驗除特殊說明外,所有指標測定均重復3次,結(jié)果以平均值±標準差形式表示。所有試驗數(shù)據(jù)使用Excel進行處理,采用SPSS 19.0軟件對測定指標進行統(tǒng)計分析。
由表3可知,2個處理組的L*值隨冷藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢,其中在冷藏的3~7 d,PLA/PBAT包裝組與對照組的差異顯著(P<0.05),而PA/PE包裝組與對照組的差異不顯著(P>0.05)。A*值在冷藏期內(nèi)呈逐漸下降的趨勢,這主要是由于宰后肌肉隨著氧分壓的增大,氧合肌紅蛋白被進一步氧化成高鐵肌紅蛋白所致。其中在3~7 d時,PLA/PBAT包裝組與對照組差異顯著(P<0.05)。3種處理組的b*都隨時間的延長逐漸上升,PLA/PBAT包裝組、PA/PE包裝組和對照組分別增加了28%、29%和35%。
表3 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對冷卻藏羊肉色度值的影響Table 3 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on the color value of chilled Tibetan mutton
注:不同字母(a~d)表示冷藏期內(nèi)差異顯著 (P<0.05),不同字母(A~C)表示不同處理組之間的差異顯著(P<0.05)
冷卻肉色澤顯著影響消費者的購買決定[22]。而氧合肌紅蛋白含量決定這消費者所需的鮮肉的健康顏色。如圖1所示,3個包裝組OMb的相對含量均隨冷藏時間的延長而降低,這是由于隨著冷藏時間的延長,氧分子的滲透量增多,血紅素輔基內(nèi)的還原態(tài)鐵離子被逐漸氧化成氧化態(tài)鐵離子,從而引起冷卻肉的色澤劣變。其中PLA/PBAT包裝組的OMb相對含量在1~5 d下降緩慢,在5~7 d下降變快,而無包裝處理組的氧合肌紅蛋白在1~3 d呈現(xiàn)大幅下降。且由圖1可知,PLA/PBAT包裝處理組合PA/PE包裝處理組的氧合肌紅蛋白相對含量顯著高于未包裝組(P<0.05),在第7天時2個包裝處理組的差異顯著(P>0.05)。
圖1 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對氧合肌紅蛋白相對含量的影響Fig.1 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on the relative contents of oxygen and myoglobin注:不同字母(a~d)表示冷藏期內(nèi)差異顯著(P<0.05),不同字母(A~C)表示不同處理組之間的差異顯著(P<0.05)(下同)
MMb相對含量的逐漸增加,是引起鮮肉色澤劣變的主要原因。如圖2所示,3個處理組肉樣的MMb相對含量都是隨冷藏時間的延長而逐漸增加的。其中PLA/PBAT包裝組的MMb相對含量在1~5 d上升緩慢,在5~7 d上升加快,而對照組的MMb在3~5 d呈現(xiàn)大幅上升。RIORDAN報道稱[23], MMb含量和消費者的選擇可能性之間存在顯著的負相關(guān),當MMb的相對含量高于60%時,鮮肉色澤已不能被消費者接受。由圖2可知,對照組的MMb的相對含量在冷藏第7天時高達67.15%,由此可見,此時的冷卻肉已不能被大眾所接受。此外,PLA/PBAT包裝的MMb相對含量在冷藏期間顯著低于PA/PE包裝組(P<0.05)。本試驗研究結(jié)果表明,隨著冷藏時間的延長,OMb的相對含量逐漸降低,而MMb的相對含量逐漸增加,這主要是由于隨著氧氣的滲透量增加,肌肉中的OMb被氧化為MMb,亞鐵離子被氧化成高鐵離子,肌肉的顏色發(fā)生劣變,冷卻肉品質(zhì)逐漸劣化。由此說明相對于PA/PE包裝組,PLA/PBAT包裝組的阻隔性更好,其很好地阻隔氧氣的滲透,從而延緩MMb生成速率。
圖2 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對高鐵肌紅蛋白相對含量的影響Fig.2 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on the relative content of metmyoglobin
肉中的MMb還原主要是由于發(fā)生以NADH為輔酶的酶促和非酶促反應,也就是說NADH是限制MMb還原的關(guān)鍵[24]。宰后肌肉代謝的限制因素可能是缺乏足夠的底物而不是酶,而乳酸鹽可以充當這個補充劑[25]。WATTS等[26]研究發(fā)現(xiàn)為肌肉提供充足的乳酸和LDH,其中氫離子可能通過LDH從乳酸轉(zhuǎn)移到NAD+,將NAD+還原為NADH,從而加快MMb的還原速率。由圖3可知,3種處理的NADH濃度隨冷藏時間的延長逐漸降低,其中2種不同包裝處理組的NADH濃度都在1~5 d下降較快,在5~7 d下降速度降低,在第7天時2種包裝處理組的差異不顯著(P>0.05)。冷藏結(jié)束與開始相比較PLA/PBAT、PA/PE和對照組分別下降了58%、60%、76%。其中PLA/PBAT包裝組的NADH濃度顯著高于對照組(P<0.05)。因此PLA/PBAT包裝膜相對于PA/PE包裝膜和對照組可以很好地延緩NADH濃度的降低,達到穩(wěn)定肉色的目的。
圖3 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對NADH濃度的影響Fig.3 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on NADH concentration
MMbR系統(tǒng)是影響MMb還原的因素之一,這些酶系統(tǒng)主要是MMbR。MMbR不是單獨的一種酶類,而是一類與肉色有關(guān)酶類的統(tǒng)稱。LEDWARD等[27]認為MMbR是影響牛肉表面形成MMb速度的主要因素,是控制牛肉中MMb積累速率最重要的內(nèi)在因素,同時他也發(fā)現(xiàn)不同肌肉的MMbR活性與肌肉顏色的差異具有高度的相關(guān)性。由圖4可知,2種包裝處理組的MMbR活力隨冷藏時間的延長呈下降趨勢,MMbR活力在1~5 d下降迅速,在第5天后下降緩慢,且對照組與PLA/PBAT包裝組和PA/PE包裝組具有顯著的差異性(P<0.05)。這同MANCINI等[28]學者的研究結(jié)果基本一致。而本文中MMbR活性略高一方面可能是由于本試驗注射了乳酸鹽,其作為補充劑提高了還原氫的濃度,進而提高了冷卻肉的MMb還原能力,另一方面MMbR主要位于線粒體內(nèi)膜上,而肌肉中線粒體結(jié)構(gòu)會隨著冷藏時間的延長受到一定的破壞,其在一定程度上影響著MMbR活力。
圖4 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響Fig.4 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on high iron myoglobin reductase
LDH又稱NAD+氧化酶,是脫氫酶中研究較多的酶類,因為糖酵解過程的丙酮酸要在此酶的作用下生成乳酸,所以其在糖代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。不同肌肉可以通過不同的NADH補充率來調(diào)節(jié)LDH活性[29],也可通過LDH影響高鐵肌紅蛋白的還原速率來補充NADH[28],從而有助于肉色穩(wěn)定性的維持。如圖5所示,3個包裝處理組肉樣的LDH活力隨貯藏時間的延長而呈逐漸下降的趨勢,此變化趨勢與NADH的變化趨勢一致。其中PLA/PBAT包裝組在1~3 d下降緩慢,3~7 d下降變快,而對照組在1~3 d呈現(xiàn)大幅下降,在第7天時對照組的LDH活力最低,為5.82 mol/(min·g)。在冷藏的7 d內(nèi)PLA/PBAT包裝組的LDH活性與對照組具有顯著的差異性(P<0.05)。通過3種處理的比較,發(fā)現(xiàn)PLA/PBAT包裝膜能很好地延緩LDH活力的下降速度,保持鮮肉的色澤,這與劉金鑫的研究結(jié)果基本一致[30]。
圖5 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對乳酸脫氫酶活力的影響Fig.5 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on the activity of lactate dehydrogenase
線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔的大量開啟,造成線粒體內(nèi)分子質(zhì)量低于1.5 kDa的溶質(zhì)通透性突然暴增,內(nèi)膜上的質(zhì)子泵可以將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子通過通道運輸?shù)酵馐遥藭r內(nèi)膜內(nèi)外的離子就會分布不均勻,形成了線粒體的膜電位。線粒體膜電位是線粒體具有正常生理功能的典型特征,當線粒體受到嚴重損傷時,線粒體膜電位會消失,線粒體內(nèi)部的正常代謝會被干擾,其上所存在的還原酶系也會受到影響,當然與此同時線粒體的氧消耗也會降低[31]。隨冷藏時間的延長,線粒體膜電位易發(fā)生崩解。如圖6所示,隨冷藏時間的延長,線粒體膜電位會發(fā)生崩解而逐漸降低,其中3種處理的線粒體膜電位都在1~3 d大幅下降,其中PLA/PBAT包裝處理和對照組的線粒體膜電位在第7天時分別為0.43和0.35,與第1天相比下降了61.7%和68%。
圖6 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對線粒體膜電位的影響Fig.6 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on mitochondrial membrane potential
肌肉宰后由于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開,線粒體內(nèi)膜的通透性會隨著通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而不斷地上升,內(nèi)膜中的氫離子梯度也會因線粒體膜通透性的開放出現(xiàn)失常的現(xiàn)象。線粒體膜通透性隨著冷藏時間的延長逐漸降低,這主要由于宰后肌肉中產(chǎn)生較多自由基,產(chǎn)生的自由基會造成線粒體膜電位逐漸消失,線粒體膜通透性和完整性也會發(fā)生不可逆的損傷。由圖7可知,3種處理的線粒體膜通透性在冷藏期間呈下降趨勢。線粒體膜通透性在1~3 d下降緩慢,5 d后線粒體膜通透性下降速度加快,且PLA/PBAT包裝組的線粒體膜通透性顯著高于PA/PE包裝組(P<0.05),通過本實驗測定發(fā)現(xiàn),3種處理的線粒體膜電位和膜通透性在冷藏期間均呈現(xiàn)下降趨勢,其中PLA/PBAT的下降速度低于PA/PE包裝組低于對照組,說明PLA/PBAT包裝組中的線粒體結(jié)構(gòu)保持的相對較為完整,其所上存在的酶系和電子傳遞鏈相對完整,可以較好地穩(wěn)定冷卻肉的色澤,增加顏色穩(wěn)定性。
圖7 乳酸鈣注射增強結(jié)合不同包裝材料對線粒體膜通透性的影響Fig.7 Effect of calcium lactate injection combined with different packaging materials on mitochondrial membrane permeability
在乳酸鈣注射增強的條件下,通過用不同包裝材料包裝藏羊后腿肉,經(jīng)過1~7 d的貯藏,發(fā)現(xiàn)冷藏期間PLA/PBAT包裝組的L*值隨冷藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢且與對照組差異顯著(P<0.05),3種處理組的a*值在冷藏期內(nèi)呈逐漸下降的趨勢,b*值都隨時間的延長逐漸上升。MMbR活力降低速度明顯低于其他2組,而PLA/PBAT包裝膜的OMb相對含量、NADH含量和LDH活力高于PA/PE組,而MMb相對含量低于PA/PE組。隨著貯藏時間的延長,PLA/PBAT包裝組的線粒體膜電位和膜通透性下降速度均顯著小于PA/PE組(P<0.05)。從整個實驗結(jié)果來看,PLA/PBAT包裝膜較于PA/PE具有高阻隔性,更有效地減少MMb的積累量,且減緩線粒體生理結(jié)構(gòu)的損失速度,對保持冷卻肉色穩(wěn)定的作用最明顯,使藏羊肉具有較好的色澤,易于被消費者接受,適合藏羊肉的貯藏。