不孕癥患者子宮內(nèi)膜息肉ER、PR、Ki-67 及β-catenin 的表達(dá)及病因探討

莫曉榮，王娟，張賓，任菲，黎曉虹，李玲秋，徐春蘭，甘艷屏

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院，廣西 南寧)

0 引言

子宮內(nèi)膜息肉(Endometrial Polyps EP)是由腺體、間質(zhì)、厚壁血管組成的突出于宮腔內(nèi)的良性病變，有文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率為24%～25%[1]，但部分患者也可出現(xiàn)惡性腫瘤，絕經(jīng)后息肉惡變的患病率是5.42%，生育年齡息肉惡變的患病率是1.51%[2]。現(xiàn)在不孕癥患者越來越多，子宮內(nèi)膜息肉是子宮性因素中的重要原因之一，而子宮內(nèi)膜息肉的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制仍不明確。本研究選取2018 年1 月至2019 年6 月的136 例不孕癥患者的臨床資料進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討EP 的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018 年1 月至2019 年6 月就診于廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院婦科的136 例不孕癥患者，于月經(jīng)干凈后2-5 天宮腔鏡下切除息肉或子宮內(nèi)膜活檢，其中宮腔鏡檢查且病理診斷為子宮內(nèi)膜息肉有76 例，正常子宮內(nèi)膜息肉有60 例(病理檢查為增殖期子宮內(nèi)膜)。

病例取材前3 個(gè)月均無接受過任何激素治療及放置宮內(nèi)節(jié)育器，無生殖道炎癥及婦科腫瘤等病史。本研究遵循的程序符合本院人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得受試對(duì)象本人的知情同意，并與之簽署臨床研究知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和主要儀器

ER 抗 體(abcam 公 司，ab32063)，PR 抗 體(abcam 公 司，ab2765)，PTEN 重組抗體(abcam 公司，ab170941)，β-catenin 抗體(abcam 公司，ab194118)，驢抗兔IgG H&L (HRP)(abcam 公司，ab6802)，通用二步法試劑盒(小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)，PV-9000)(中杉金橋公司)，DAB 染色試劑盒20X(中杉金橋公司)，電壓力鍋(美的公司)，熒光顯微鏡(BX53)(日本Olympus 公司)，Leica Leitz 1512 Rotary Microtome 切片機(jī)(Leica 公司)

1.2.2 ER、PR 及Ki-67 檢測(cè)均采用免疫組化進(jìn)行，常規(guī)石蠟切片脫蠟、梯度酒精進(jìn)水，使用檸檬酸鹽高壓修復(fù)(10min)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育(10min)，PBS 沖洗，反應(yīng)增強(qiáng)液室溫孵育(20min)，PBS 沖洗(3×3min)，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物室溫孵育1.5h，PBS 沖洗(3×3min)，DAB 染色(4min)，PBS 沖洗(3×3min)，蘇木素復(fù)染數(shù)秒，蒸餾水沖洗(3×1min)。酒精升濃度脫水(5×5min)，二甲苯透明(2min)，樹脂封片。使用中杉金橋PV-9000 試劑盒并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 β-catenin 的檢測(cè)采用熒光免疫實(shí)驗(yàn)，常規(guī)石蠟切片脫蠟、梯度酒精進(jìn)水，使用檸檬酸鹽高壓修復(fù)5min 后放置冷卻至室溫。PBS 沖洗，PBS-GT 浸泡4×12min，加入β-catenin 抗體，然后置于37℃中孵育2h。PBS 清洗，使用熒光增強(qiáng)劑封片。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 ER、PR 及Ki-67 結(jié)果判定

①細(xì)胞核內(nèi)含棕黃色顆粒者為受體陽性細(xì)胞，按百分比計(jì)分，0 分：陽性細(xì)胞＜5%；1 分：陽性細(xì)胞5%～25%；2 分：陽性細(xì)胞26%～50%；3 分：陽性細(xì)胞51%～75%；4 分：陽性細(xì)胞＞75%。②細(xì)胞質(zhì)按染色強(qiáng)度計(jì)分，1 分：染色呈淡黃色；2 分：染色呈黃色；3 分：染色呈棕黃色。③將二者計(jì)分相乘即得出陽性強(qiáng)度，(-)：0 分；(+)：1～4 分；(++)：5～8 分；(+++)：9～12 分。

1.3.2 β-catenin 結(jié)果判定

計(jì)數(shù)500 個(gè)腺體細(xì)胞，細(xì)胞核或者細(xì)胞膜含綠色熒光標(biāo)記者為陽性細(xì)胞，按百分比計(jì)分，0 分：陽性細(xì)胞＜5%；1 分：陽性細(xì)胞5%～25%；2 分：陽性細(xì)胞26%～50%；3 分：陽性細(xì)胞51%～75%；4 分：陽性細(xì)胞＞75%。陽性強(qiáng)度(-)：0 分；(+)：1 分；(++)：2 分；(+++)：3 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，各組之間陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 136 例患者年齡為22-40 歲，其中對(duì)照組年齡為(32.45±4.967)歲，觀察組年齡(33.44±6.405)歲(P＞0.05)，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組月經(jīng)周期為(27.45±3.95)天，觀察組月經(jīng)周期為(28.32±3.205)天(P＞0.05)，兩組月經(jīng)周期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 觀察組及對(duì)照組的ER、PR、Ki-67 及β-catenin 表達(dá)陽性率比較

觀察組患者的ER 表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PR、Ki-67 及β-catenin 的表達(dá)陽性率均低于對(duì)照組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組的ER、PR、Ki-67 及β-catenin 陽性表達(dá)比較[例(%)]

3 討論

子宮內(nèi)膜息肉是婦科常見病，可發(fā)生在青春期后的任何年齡，其中較多發(fā)生在育齡期及圍絕經(jīng)婦女，可無臨床癥狀，有時(shí)通過B 超檢查發(fā)現(xiàn)，或臨床表現(xiàn)為經(jīng)量多，經(jīng)期延長(zhǎng)及不孕等癥狀，因其缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，容易漏診及誤診[3]。目前，引起子宮內(nèi)膜息肉的病因及發(fā)病機(jī)制還不明確，有觀點(diǎn)認(rèn)為[4]與炎癥刺激有關(guān)，認(rèn)為在整個(gè)月經(jīng)周期中，EP 激活的肥大細(xì)胞數(shù)目比正常子宮內(nèi)膜的高7 倍多，比如反復(fù)宮腔操作、流產(chǎn)術(shù)及放置宮內(nèi)節(jié)育器等。

有些學(xué)者認(rèn)為可能與細(xì)胞增殖、凋亡失衡相關(guān)，Ki-67 是一種與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的核抗原，可以反映細(xì)胞的增殖活性，其表達(dá)增強(qiáng)是細(xì)胞增殖活性增加的可靠標(biāo)記。Ki-67 幾乎在全身各部位腫瘤的增殖細(xì)胞中均有表達(dá)，認(rèn)為Ki-67 的高表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生可能具有預(yù)測(cè)作用[5]。而Risberg 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在未絕經(jīng)婦女的子宮內(nèi)膜息肉中Ki-67 呈現(xiàn)低表達(dá)。本研究中Ki-67在觀察組與對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究中的樣本量少有關(guān)，可在之后的研究中擴(kuò)大樣本量再進(jìn)一步探討。

現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與激素刺激學(xué)說相關(guān)，認(rèn)為EP 為激素依賴性疾病，雌激素可促進(jìn)細(xì)胞分裂，促使子宮內(nèi)膜增生，孕激素可對(duì)抗這種作用，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，發(fā)生周期性撤退剝脫，高雌激素、低孕激素狀態(tài)可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜過度增殖，促使子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生[4]。研究同樣表明，子宮內(nèi)膜息肉的形成以子宮內(nèi)膜局部ER、PR 失衡為主，使子宮內(nèi)膜對(duì)雌激素、孕激素反應(yīng)不一致，ER 表達(dá)較高的子宮內(nèi)膜可在雌激素的刺激下過度增生，PR 的低表達(dá)使孕激素抑制ER 生成的作用減弱，導(dǎo)致ER 持續(xù)高水平表達(dá)，局部組織接受了雌激素的持續(xù)刺激而呈現(xiàn)顯著增殖狀態(tài)，組織過度增生最終形成子宮內(nèi)膜息肉[7]。本研究也表明ER 在子宮內(nèi)膜的局部組織中表達(dá)并不一致，ER 在觀察組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而PR 在觀察組與對(duì)照組的表達(dá)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ER 在息肉組織中的高表達(dá)對(duì)雌激素敏感，可認(rèn)為局部組織相對(duì)接受了雌激素的持續(xù)刺激 ，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜過度增生形成子宮內(nèi)膜息肉，與夏蘭恩等[8]提出的觀點(diǎn)基本一致。本文研究病例均為卵泡期子宮內(nèi)膜，可能導(dǎo)致研究結(jié)果有一定的局限性。

2003 年KIM 等[9]提出子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)與EP 具有相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EMT 合并有EP 的發(fā)病率高達(dá)47.6%～68.4%，而在EMT 相關(guān)不孕癥中EP 的發(fā)病率更是明顯升高。本研究子宮內(nèi)膜異位癥不孕癥患者中合并EP 的發(fā)生率為46.1%，非子宮內(nèi)膜異位癥不孕癥患者中合并EP 的發(fā)生率為21.7%(P＜0.05)。有學(xué)者提出EMT 與EP 都表現(xiàn)為雌激素依賴性增生過長(zhǎng)，均能導(dǎo)致不孕，認(rèn)為兩者可能存在相同的生理病理基礎(chǔ)，需進(jìn)一步研究?jī)烧叩陌l(fā)病機(jī)制，有助于提高其臨床診治率，同時(shí)也可進(jìn)一步提高不孕癥的治愈率[10]。

β-catenin 是一種多功能蛋白，游離型β-catenin 通過核膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與DNA 親和蛋合，激活Wnt 途徑靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增生，參與腫瘤形成，隨著子宮內(nèi)膜病變的進(jìn)展，細(xì)胞膜中β-catenin 蛋白表達(dá)減少，而細(xì)胞核中β-catenin 蛋白表達(dá)增加[11]。有研究提出β-catenin 蛋白在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁組織中高表達(dá)，雌激素 (E2) 上調(diào)β-catenin 表達(dá)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)，可能參與子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)的發(fā)病[12]，而EMT 與EP 有臨床相關(guān)性，可對(duì)三者的相關(guān)性進(jìn)一步研究。在本研究中，β-catenin在兩組陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為β-catenin 的異常表達(dá)參與子宮內(nèi)膜息肉的形成。但有學(xué)者[13]提示β-catenin 可能與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)，推測(cè)β-catenin 可作為鑒別子宮內(nèi)膜息肉和子宮內(nèi)膜腺癌疾病的標(biāo)志物。

子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖活躍、凋亡減低、血管形成能力與子宮內(nèi)膜息肉形成相關(guān)，如P63 蛋白高表達(dá)、凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表達(dá)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的高表達(dá)和微血管密度(MVD)的增加等[11]。近期，有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜息肉的形成與金屬的氧化應(yīng)激相關(guān)，如銅/鋅比值，但是與血清中金屬雌激素(金屬離子與雌激素受體結(jié)合形成)水平的升高無關(guān)，目前還沒有相關(guān)研究提出這些金屬雌激素的水平[14]。

筆者認(rèn)為局部子宮內(nèi)膜的ER 異常表達(dá)參與了子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生發(fā)展，此外，子宮內(nèi)膜息肉的形成可能與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān)，可能受到其他金屬的氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等的調(diào)控，因此還需要更多的研究。