水稻成花素基因RFT1對抽穗期的促進作用

王世林 張振華 朱玉君 樊葉楊 莊杰云

（中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室/國家水稻改良中心，杭州310006；第一作者：15621566500@163.com；*通訊作者：zhuangjieyun@caas.cn）

南方雙季稻區(qū)是我國水稻的主要產(chǎn)區(qū)之一。雙季稻種植模式有利于充分利用光溫資源，增加水稻復(fù)種指數(shù)，從而提高水稻產(chǎn)出能力，保障農(nóng)民的經(jīng)濟收入[1]；同時，雙季稻種植模式能夠降低由自然災(zāi)害所引起的減產(chǎn)風(fēng)險[2]。自2014 年以來，我國水稻種植面積已連續(xù)5 年減少[3-4]；同時，我國水稻生產(chǎn)進入效益優(yōu)先階段，單位面積的高效率產(chǎn)出將是今后的重要生產(chǎn)目標[5]。進一步縮短早稻品種的生育期，能夠為后茬晚稻提供更充足的生育時間，優(yōu)化晚稻產(chǎn)出，從而提高雙季稻的生產(chǎn)潛能。因此，挖掘能夠促進早稻品種抽穗，同時不會導(dǎo)致稻谷產(chǎn)量大幅度下降的基因，對我國南方雙季稻區(qū)的糧食安全生產(chǎn)具有重要意義。

近20 年來，水稻抽穗期的遺傳和分子機理研究取得巨大進步，其主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已基本明確[6]。在獲得克隆的水稻抽穗期基因中，有7 個在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中居關(guān)鍵地位，分別是 Hd3a、RFT1、Hd1、Hd2、Ghd7、DTH8 和Ehd1。Hd3a 和RFT1 是水稻的2 個成花素基因，前者主要在短日照條件下發(fā)揮作用，后者主要在長日照條件下發(fā)揮作用，其他抽穗期基因通過調(diào)控Hd3a 和RFT1 影響抽穗[7-8]；Hd1 和 Ehd1 分別是水稻抽穗期 2條主要調(diào)控通路的核心基因，前者在長、短日照條件下作用差異很大，后者的功能型等位基因在長、短日照條件下均促進抽穗[9-10]；Hd2、Ghd7 和 DTH8 通過與 Hd1和Ehd1 的相互作用影響抽穗[11-14]。在我國長江中下游稻區(qū)和華南稻區(qū)中，早秈品種生長于長日照條件下均攜帶Ehd1 的早熟功能型等位基因；在Hd1 和Ghd7 座位上，該類品種均擁有早熟型組合，不攜帶功能型等位基因或僅在1 個座位攜帶功能型等位基因；在Hd2 和DTH8 座位上，絕大部分早秈品種攜帶不延遲抽穗的功能缺失型等位基因[14-15]。

前期研究表明，在其他抽穗期基因不分離的背景下，RFT1 本身的等位變異對水稻抽穗期和產(chǎn)量性狀具有重要影響。與來源于早秈品種珍汕97 的等位基因相比，來源于中秈品種密陽46 的等位基因具有促進抽穗、降低產(chǎn)量的作用。當遺傳背景中抽穗期基因呈珍汕97 純合型和密陽46 純合型自然混合時，密陽46 型RFT1 等位基因在長日照條件下促進抽穗18.4～31.2 d，同時對產(chǎn)量具多效性[16]；當遺傳背景中Hd1 座位固定為珍汕97 純合型時，RFT1 的作用大幅度減弱[17]。本研究以珍汕97 和密陽46 為雙親構(gòu)建新群體，進一步固定RFT1 之外6 個關(guān)鍵抽穗期基因的作用，在早秈遺傳背景和自然長日照種植條件下，分析RFT1 對抽穗期和產(chǎn)量性狀的遺傳作用，探討利用RFT1 進一步縮短早稻抽穗期的途徑。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究所用水稻材料為衍生于珍汕97//珍汕97/密陽46 組合的2 個分離群體。在這2 個群體中，RFT1均呈分離，而其他6 個關(guān)鍵抽穗期基因（Hd3a、Hd1、Hd2、Ghd7、DTH8 和 Ehd1）均無功能性變化。其構(gòu)建過程如圖1：從珍汕97/密陽46 的F9群體挑選出1 個單株，與珍汕97 回交，連續(xù)自交加代至BC1F4，回交、自交過程中所挑選單株均為傾向于早熟的材料；經(jīng)標記鑒定，篩選到在RFT1 位點座位上呈雜合的BC1F4單株2個，自交獲得世代為BC1F5的近等基因系-F2（NIL-F2）群體，共含543 個單株，稱之為Z3；經(jīng)標記鑒定，從該群體挑選RFT1 純合型單株，自交構(gòu)建了1 個含有46個珍汕97 純合型株系和55 個密陽46 純合型株系的NIL 群體，稱之為 R3。

表1 本研究所用群體及其親本在7 個關(guān)鍵抽穗期基因上的功能型

圖1 材料構(gòu)建過程

1.2 田間試驗與性狀考查

所有群體均種植于中國水稻研究所試驗基地（杭州富陽），種植季節(jié)均屬長日照條件，其中，NIL-F2群體Z3 種植于 2017 年，5 月 24 日播種，6 月 16 日移栽；NIL 群體 R3 種植 2 年，2018 年于 4 月 18 日播種，5 月15 日移栽，2019 年于 4 月 18 日播種，5 月 16 日移栽。株行距為16.7 cm×26.7 cm，正常大田管理。對于NILF2群體Z3，記載各單株抽穗期，不考種。對于NIL 群體R3，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，2 次重復(fù)，每重復(fù)每株系種植1 行10 株，記載各單株抽穗期，取平均值進行數(shù)據(jù)分析；成熟期每株系混收中間5 株，考查單株穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量。千粒重考查遵循ZHANG 等[18]方法。

1.3 抽穗期基因分析與標記檢測

采用實驗室保存的珍汕97 和密陽46 序列資料，分析雙親在7 個抽穗期基因上的功能型及雙親差異；根據(jù)雙親差異設(shè)計引物，檢測群體。水稻材料移栽10 d后，每個單株取約2 cm 幼葉，采用ZHENG 等[19]方法提取DNA。PCR 擴增按照CHEN 等[20]方法進行，擴增產(chǎn)物使用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠或2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，分別使用銀染和GelRed 檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對于NIL-F2群體Z3，應(yīng)用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件[21]中單標記作圖法進行QTL 分析，以LOD=3.0 為閾值。對于NIL 群體R3，應(yīng)用SAS 軟件一般線性模型（Proc GLM）[22]，采用雙因素方差分析法檢驗2 種基因型之間的表型差異，具體方法同DAI 等[23]所述；若差異達到顯著水平（P＜0.05），則計算加性效應(yīng)和貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體遺傳背景

圖2 NIL-F2 和NIL 群體的抽穗期表型分布

圖3 NIL 群體的產(chǎn)量性狀表型分布

根據(jù)珍汕97 和密陽46 的基因組序列，確定了它們在7 個目標基因座位上的功能型及差異情況（表1）。有3 個基因在2 個親本之間無功能差異，其中，Hd3a 和Ehd1 為功能型等位基因，DTH8 為功能缺失型等位基因；根據(jù)這3 個基因?qū)λ境樗肫诘淖饔?，雙親所攜帶的等位基因均屬早熟型。在其余4 個基因上，雙親之間存在功能差異：在RFT1 上，珍汕97 攜帶遲熟型等位基因，密陽46 攜帶早熟型等位基因；在Hd1 上，珍汕97 為強感光型，密陽46 為無感光型；在Hd2 上，珍汕97 為無感光型，密陽46 為強感光型；在Ghd7 上，珍汕97 為無功能型，密陽46 為強功能型。經(jīng)檢測構(gòu)建分離群體的2 個BC1F4單株，發(fā)現(xiàn)這2 份材料除了RFT1 為雜合型外，其余3 個基因均為珍汕97 純合型，即強感光型Hd1、無感光型Hd2 和無功能型Ghd7。無感光型Hd2 和無功能型Ghd7 喪失了在長日照條件下延長抽穗的作用，而強感光型Hd1 在無功能型Ghd7背景下具有促進抽穗的作用[12-13，24-25]。因此，Z3 和 R3 群體中Hd1、Hd2 和Ghd7 的基因型組合亦為早熟型。綜上所述，本研究所用群體RFT1 呈分離，其余6 個關(guān)鍵抽穗期基因均與珍汕97 功能型一致，為早熟型遺傳背景。

2.2 表型變異

在Z3 群體1 年試驗和R3 群體2 年試驗中，抽穗期均呈連續(xù)分布。以RFT1 基因型對群體內(nèi)材料分類，可以發(fā)現(xiàn)，與珍汕97 純合型材料相比，密陽46 純合型材料趨向于早熟（圖2）。該結(jié)果表明，在Z3 和R3 群體中，成花素基因RFT1 可能對抽穗期的變異具有顯著作用。在考查了產(chǎn)量性狀的R3 群體2 年試驗中，各性狀表型亦呈連續(xù)分布，且密陽型株系趨向分布于低值區(qū)（圖3），表明RFT1 在這些試驗中表現(xiàn)出對產(chǎn)量性狀的多效作用。

2.3 QTL分析

NIL-F2群體中，Windows QTL Cartographer 2.5 結(jié)果顯示，RFT1 對抽穗期呈顯著作用（LOD=13.05），來自密陽46 的等位基因促進提早抽穗1.21 d，顯性效應(yīng)為0.62 d，貢獻率為10.46﹪。

雙因子方差分析結(jié)果顯示，在NIL 群體R3 中，RFT1 表現(xiàn)出對抽穗期、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量的顯著作用，而對單株穗數(shù)無顯著作用（表2）。2018 年，密陽46 等位基因促進抽穗，加性效應(yīng)為0.84 d，貢獻率為18.62%；同時，密陽46 等位基因降低每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量，加性效應(yīng)分別為 3.06 粒、2.98 粒、0.12 g 和 0.63 g，貢獻率分別為1.66%、2.13%、2.53%和2.76%。2019 年，密陽46等位基因亦促進抽穗并降低每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)和單株產(chǎn)量，加性效應(yīng)分別為0.89 d、2.02 粒、1.48 粒和 0.38 g，貢獻率分別為 18.48%、1.91%、0.99%和1.48%；在千粒重上處于臨界水平，P 值為0.0652，加性效應(yīng)和貢獻率分別為0.08 g 和1.28%。綜上結(jié)果表明，在早熟遺傳背景和自然長日照種植條件下，水稻成花素基因RFT1 不僅對抽穗期具有顯著作用，同時對產(chǎn)量性狀呈多效作用。

表2 近等基因系群體中RFT1 對抽穗期和產(chǎn)量性狀的作用

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用早秈稻珍汕97 與中秈稻密陽46 為雙親材料，針對 Hd3a、RFT1、Hd1、Hd2、Ghd7、DTH8 和 E－h(huán)d1 這7 個控制水稻抽穗期的關(guān)鍵基因，構(gòu)建了RFT1分離、其余6 個基因均為早熟基因型的群體，分析了RFT1 對抽穗期和產(chǎn)量性狀的遺傳作用。結(jié)果表明，在早熟型遺傳背景和自然長日照種植條件下，與早秈稻珍汕97 相比，中秈稻密陽46 的RFT1 等位基因能夠穩(wěn)定促進水稻抽穗，同時對產(chǎn)量性狀具有微效作用。

抽穗期屬于數(shù)量性狀，由主效和微效數(shù)量性狀座位（QTL）共同控制。主效QTL 主要影響水稻品種的地區(qū)和季節(jié)適應(yīng)性；而微效QTL 在相同或相似的生態(tài)適應(yīng)區(qū)域內(nèi)通過微調(diào)抽穗期，在充分利用自然資源或規(guī)避逆境脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。近年來，水稻抽穗期微效QTL 的研究逐漸受到重視，迄今有4 個微效QTL 獲得克隆、3 個QTL 得到精細定位[26-32]。此外，一些已克隆的主效QTL 在特定的遺傳背景或環(huán)境條件下，也呈現(xiàn)出微效作用。例如，TAKEUCHI 等[33]利用分子標記輔助選擇，將水稻品種Kasalath 的Hd4/Ghd7 等位基因?qū)肓硪黄贩NKoshihikari 中，使其抽穗期延長約3 d，同時增加了穗長和單株產(chǎn)量；ZHAO 等[34]以 T65 和 GLA 為雙親構(gòu)建的新材料中，在抽穗期基因組合為Hd3a、RFT1、Hd1 和 ghd7 的背景下，Ehd1-GLA 在長日照條件下促進水稻抽穗約5 d；FUJINO 等 [35]以早熟品種Hoshinoyume 為受體親本，構(gòu)建了 NIL（hd5/dth8），在長日照條件下較親本延遲抽穗5.2 d。在本研究中，RFT1在早熟遺傳背景和長日照種植條件下呈現(xiàn)出微效作用，3 年加性效應(yīng)為0.84～1.21 d。我們可以將RFT1 的這一特性利用到早稻品種的抽穗期精準調(diào)控中，以最大化利用自然資源和規(guī)避自然災(zāi)害。綜上表明，針對已克隆的主效QTL，構(gòu)建特定的遺傳背景材料來分析它們的微效作用，一方面可以獲得新的微效QTL 資源，另一方面可為主效變微效分子機理研究提供基礎(chǔ)。

進一步縮短早稻品種的生育期，為后茬晚稻提供更充裕的生長發(fā)育時間，是我國南方雙季稻區(qū)一個重要的育種目標。本研究結(jié)果表明，密陽46 的RFT1 等位基因能夠進一步縮短早稻的生育期，為晚稻提供更充裕的生長時間，進而提高雙季稻的生產(chǎn)潛能。據(jù)浙江省品種審定條例，早秈稻參試品種全生育期比對照縮短1.0～3.0 d 的，產(chǎn)量要求每縮短1.0 d 可以比對照減產(chǎn)2.0%；縮短4.0 d 及以上的天數(shù)，每縮短1.0 d，可比對照減產(chǎn)3.0%。本研究2018 年和2019 年NIL 結(jié)果顯示，中秈稻密陽46 型RFT1 分別促進水稻提早抽穗1.68 d 和 1.78 d，降低單株產(chǎn)量 1.26 g 和 0.76 g，符合早秈品種審定需求。由此可見，來源于其他品種類型的RFT1 等位基因，可為南方雙季稻區(qū)特早熟水稻品種的培育提供新的資源。