MC4R基因、SIM1基因在從江香豬不同組織中的mRNA表達規(guī)律研究

李 俊，毛世明，周 迪，馮文武，李 平，陳大芳，龍清孟，李建偉，謝 艷，王 舍，唐明宗

（貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550021）

黑素皮質(zhì)激素受體-4（Meloaocrtin Recepto-4,MC4R）是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromadial hypothalam,VMH）分泌的一種肽類物質(zhì)，在哺乳動物中主要與食欲和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)，是第一個發(fā)現(xiàn)的與人類顯性遺傳性肥胖相關(guān)的靶位點[1]。而SIM1（Singleminded 1）基因是一種編碼與神經(jīng)發(fā)生有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族中新發(fā)現(xiàn)的亞家族成員之一[2]，通過影響下丘腦視上核和室旁核神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在哺乳動物能量平衡調(diào)節(jié)中的作用，從而影響動物的采食行為，可導(dǎo)致食欲過盛、肥胖和體重增加[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SIM1+/-和SIM1-/-小鼠食量增加，比同窩正常小鼠肥胖，且催產(chǎn)素（Oxytocin）和黑素皮質(zhì)激素（MC4R）在下丘腦內(nèi)的表達量顯著降低[4]；由此推測，SIM1基因可能參與瘦素—黑素皮質(zhì)激素—催產(chǎn)素這一調(diào)控途徑，進而導(dǎo)致肥胖[5]。本研究擬從mRNA水平，研究MC4R基因和SIM1基因在從江香豬不同組織中的表達差異，為進一步探索MC4R基因和SIM1基因的遺傳效應(yīng)和肉質(zhì)調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗時間與地點 試驗于2018年3月至2019年6月在貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)羊昌鎮(zhèn)綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場和中心實驗室進行。

1.1.2 試驗動物 試驗對象選取8月齡從江香豬2頭，采自貴陽市烏當(dāng)區(qū)綠生源畜牧科技公司香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場；取其脂肪、脾臟、心臟、肺、胃、腎臟、小腸、背肌、肝臟9種組織樣，用生理鹽水或DEPC水沖洗后，再用錫箔紙包好立即放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 Trizol總RNA抽提試劑盒、熒光染料UltraSYBR Mixture SYBR GreenⅠ、異丙醇、DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水購于北京鼎國生物工程技術(shù)有限公司；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DL 2 000 DNA Marker購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等試劑實驗室自備。熒光定量PCR儀（CFX96），凝膠成相系統(tǒng)（G：BOX F3），紫外分光光度計（NanoDrop-ONE），去離子純水儀（Milli-Q Intergral 3），微量移液器（eppendorf）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 用Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，并用紫外分光光度計測量每個RNA樣品濃度3次，取其平均值，用ddH2O將所有DNA樣品調(diào)至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第一鏈合成 本試驗中第一鏈cDNA合成參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司MMuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明進行操作，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)或-80℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計與PCR擴增 參照GenBank上公布的豬MC4R基因mRNA序列（登錄號：DQ482582.1）、SIM1基因mRNA序列（登錄號：NM_001172585.2）、GAPDH內(nèi)參基因mRNA序列（登錄號：KJ786424.1）為模板，按照目的片段橫跨2個外顯子的原則，運用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計引物，委托賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，引物序列及擴增條件見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及條件 采用20 μL PCR反應(yīng)體系，即 cDNA 模板 1 μL，2×2×UltraSYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，RNase-Free water 8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸32 s，共34個循環(huán)；溶解曲線分析：95℃ 30 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0軟件單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Excel對數(shù)據(jù)結(jié)果進行作圖。目的基因相對表達量采用2-△△Ct方法計算，計算公式如下：目的基因相對表達量=2-△△Ct。其中△△Ct=（處理組目的基因Ct值-處理組內(nèi)參基因Ct值）-（對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物特異性及擴增效率分析

對內(nèi)參基因及目的基因進行熒光定量檢測，觀察其擴增結(jié)果。GAPDH基因、MC4R基因和SIM1基因溶解曲線均為單峰，說明所設(shè)計引物特異性良好，無引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，滿足下一步試驗要求。從擴增動力學(xué)曲線可以看出，3個基因擴增曲線均呈“S”形、拐點清晰、基線平緩且無上揚趨勢，說明這3個基因的動力學(xué)線性整體平行性較好。由3個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，其擴增效率E在1左右，相關(guān)系數(shù)R2大于0.990，可認(rèn)為GAPDH基因、MC4R基因、SIM1基因3個基因擴增效率基本相同，可用于2-△△Ct相對定量分析。

2.2 表達差異分析

本試驗通過對8月齡從江香豬不同組織進行熒光定量PCR，以脂肪中的mRNA表達量作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MC4R基因和SIM1基因mRNA在從江香豬不同組織中均有表達差異（表2）。

表2 不同組織間的mRNA表達量

由表2可知，對于MC4R基因，mRNA在從江香豬脾臟組織中相對表達量最高，為脂肪表達量的1.54倍；其他組織依次為小腸、脂肪、肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌，其相對表達量分別為脂肪表達量的1.21、1.00、0.22、0.17、0.10、0.08、0.04、0.02 倍。經(jīng)過SPSS 18.0統(tǒng)計分析，從江香豬脾臟、小腸、脂肪組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05），但與其他組織相對表達量均達到差異顯著水平（P<0.05）；而肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

由表2可知，對于SIM1基因，mRNA在從江香豬脾臟組織中相對表達量最高，為脂肪表達量的2.23倍；其他組織依次為腎臟、脂肪、肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌，其相對表達量分別為脂肪表達量的2.15、1.00、0.60、0.56、0.14、0.08、0.04、0.03 倍。經(jīng)過SPSS 18.0統(tǒng)計分析，從江香豬脾臟、腎臟、脂肪組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05），但與其他組織相對表達量均達到差異顯著水平（P<0.05）；而肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 MC4R基因表達規(guī)律

黑素皮質(zhì)激素受-4作為G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors,GPCRs）超家族的組成成員之一，屬于含7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體，在哺乳動物的采食量、體重和維持能量穩(wěn)態(tài)等方面起著重要的調(diào)控作用，它能夠通過多條信號通路調(diào)節(jié)采食和能量代謝[6]。Huszar等[7]利用基因敲除的方法首次證明了MC4R在能量平衡中的關(guān)鍵作用；而在豬的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，敲除MC4R基因的小型豬表現(xiàn)出高厭食癥、胰島素抵抗、高胰島素血癥、脂質(zhì)代謝紊亂，并且肝臟積聚了大量脂肪[8]。張子軍等[9]對山羊的研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因在山羊心臟、肝臟等10種組織中均有表達，并在腎臟組織中的表達量最高，大腸和小腸組織中的表達量最低。黃萌等[10]研究中國西門塔爾牛發(fā)現(xiàn)，MC4R基因在睪丸、小腸、心臟、胰腺、淋巴、腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、肌肉和脂肪組織中均有不同程度的表達。王婕等[11]發(fā)現(xiàn)MC4R基因在北京鴨腦組織中表達最高，脾臟、心臟、腿肌、腹脂、腎臟次之，而在肝臟和肺臟中表達量最低。本研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因mRNA在從江香豬9種組織中均有表達，但表達存在差異，在脾臟組織中相對表達量最高，其他組織依次為小腸、脂肪、肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌。

3.2 SIM1基因表達規(guī)律

SIM1基因控制下丘腦內(nèi)多種主要神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)最終階段的分化，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（尤其是下丘腦-垂體軸的視旁核細(xì)胞）和腎臟高水平表達，影響下丘腦內(nèi)視前核和室旁核細(xì)胞的發(fā)育和形成，對食欲調(diào)節(jié)起決定作用[12]。Dahmane等[13]利用原位雜交技術(shù)35S標(biāo)記探針，發(fā)現(xiàn)在16周胎兒內(nèi)SIM1基因mRNA主要表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在面部、頭骨、下頜和脊椎內(nèi)也有適量表達。而Yamaki等[14]發(fā)現(xiàn)SIM1基因mRNA主要表達在小鼠間腦區(qū)，Ema等[15]發(fā)現(xiàn)在肌肉和肺臟也有少量表達。陳哲[16]研究發(fā)現(xiàn)，SIM1蛋白在腦和下丘腦表達量最高，在睪丸的表達量次之，在肝臟、皮脂和甲狀腺表達量較高，在肌肉表達量最低，結(jié)果提示SIM1基因在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、脂肪代謝和性腺發(fā)育過程都可能起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SIM1基因mRNA在從江香豬9種組織中均有表達，但表達存在差異，在脾臟組織中相對表達量最高，其他組織依次為腎臟、脂肪、肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌。

4 結(jié)論

本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測MC4R基因和SIM1基因mRNA在從江香豬不同組織中的表達規(guī)律，結(jié)果表明，MC4R基因和SIM1基因在所檢測的從江香豬9種組織中均有表達，但在不同組織存在一定表達差異，均在脾臟中相對表達量最高，在背肌中最低，說明MC4R基因和SIM1基因在不同組織中參與調(diào)控能量代謝，但造成這種差異表達的原因還需進一步的深入研究。

聯(lián)合國秘書長發(fā)出團結(jié)抗疫疾呼—“新冠疫情是二戰(zhàn)以來最大挑戰(zhàn)”

【英國廣播公司網(wǎng)站3月31日報道】題：聯(lián)合國秘書長稱新冠疫情是“二戰(zhàn)以來最大的挑戰(zhàn)”

聯(lián)合國秘書長安東尼奧·古特雷斯警告說，目前這場新冠疫情是二戰(zhàn)以來世界面臨的最大挑戰(zhàn)。

他說，它可能會引發(fā)一場“近代歷史上無可比擬的”衰退。

古特雷斯是在聯(lián)合國發(fā)布有關(guān)新冠疫情可能造成的社會經(jīng)濟影響的報告時發(fā)表上述講話的。

目前全球確診病例超過85萬，死亡人數(shù)超過4.1萬。

古特雷斯在紐約聯(lián)合國總部說：“新冠肺炎正在攻擊社會的核心，奪走人們的生命和生計。”

古特雷斯說：“世界現(xiàn)在需要的是團結(jié)。新冠疫情是自聯(lián)合國成立以來我們共同面臨的最大考驗?！?/p>

聯(lián)合國秘書長呼吁“立即采取協(xié)調(diào)一致的衛(wèi)生應(yīng)對措施，以阻止病毒的傳播，消滅這場疫情”。

古特雷斯敦促工業(yè)化國家?guī)椭切┣钒l(fā)達國家，否則可能“面對疾病像野火一樣蔓延的噩夢”。

聯(lián)合國的報告估計，此次疫情可能在全球造成多達2 500萬個工作崗位流失。報告還預(yù)測全球外國直接投資量將面臨最高40%的“下行壓力”。

【德國電視一臺網(wǎng)站3月31日報道】題：“二戰(zhàn)以來最大挑戰(zhàn)”

聯(lián)合國估計，新冠疫情使世界面臨二戰(zhàn)以來最大挑戰(zhàn)。聯(lián)合國秘書長古特雷斯在一場視頻會議上說，疫情將帶來一場“近期不曾有過的”經(jīng)濟衰退。

他對國際社會的行動感到失望。我們正在朝正確的方向緩慢移動，但如果想打敗病毒，我們必須加快速度并且做更多事情?！彼f，應(yīng)對危機的程度必須與危機本身的規(guī)模相稱—各國和國際社會應(yīng)在世界衛(wèi)生組織領(lǐng)導(dǎo)下進行協(xié)調(diào)且全面應(yīng)對。

古特雷斯說，不僅要遏制病毒，還要共同應(yīng)對疫情帶來的經(jīng)濟后果。對發(fā)達國家來說，這更容易。它們必須幫助欠發(fā)達國家，支持后者的醫(yī)療系統(tǒng)應(yīng)對新冠疫情。聯(lián)合國正在與幾個伙伴合作成立一個專門的基金，幫助較貧窮國家應(yīng)對經(jīng)濟沖擊。

古特雷斯談到了一個選擇：有朝一日，危機結(jié)束，人們是想回到和從前一樣的世界，還是果斷解決掉使世界容易遭受此類危機的事情？從危機中復(fù)蘇也應(yīng)促成更公平、更環(huán)保的經(jīng)濟。

【德新社紐約3月31日電】聯(lián)合國秘書長古特雷斯周二表示，世界在協(xié)同抗擊新冠病毒方面正漸漸落后。與此同時，他啟動了一項計劃，以應(yīng)對此次疫情造成的社會經(jīng)濟影響。

聯(lián)合國秘書長在視頻記者會上說：“我們距離在全球范圍內(nèi)有效抗擊新冠疫情并解決其對全球經(jīng)濟和全球社會造成的負(fù)面影響這個目標(biāo)仍然非常遙遠(yuǎn)。”

古特雷斯還說：“我們遠(yuǎn)沒有制定一個幫助發(fā)展中國家的全球一攬子方案。動用的大部分資金都是發(fā)達國家用來支持它們自己經(jīng)濟的。”

他說，應(yīng)該通過擴大國際貨幣基金組織的能力來增加窮國可以獲得的資源，必須把重點放在受影響最深的人身上，包括處于戰(zhàn)火中的國家的婦女和人民。

（轉(zhuǎn)自 參考消息[N]，2020-04-02）