2019新型冠狀病毒的抗原抗體檢測(cè)

高 原， 陳 川， 王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029)

1 引 言

目前2019冠狀病毒病(COVID-19)在全球范圍爆發(fā)，這是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)入侵人體引起的一種急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2是目前發(fā)現(xiàn)的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種為人冠狀病毒229(HCoV-229)、人冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[1]。

針對(duì)COVID-19的診斷，首先主要集中于病毒核酸的檢測(cè)，即基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的核酸檢測(cè)，已成為SARS-CoV-2檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[2,3]。病毒核酸檢測(cè)過程對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、檢測(cè)人員、儀器要求比較高；并且通常需要對(duì)鼻拭子、咽拭子、肛門拭子進(jìn)行采樣[4]，采樣人員在操作過程中需嚴(yán)格控制感染風(fēng)險(xiǎn)。目前疑似病例數(shù)量較多，如果只靠病毒核酸檢測(cè)來進(jìn)行診斷，其工作量太大；并且由于樣本采集手法、樣本保存條件、PCR操作過程等因素，可能導(dǎo)致假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。增加SARS-CoV-2抗體、抗原檢測(cè)的方法來進(jìn)行輔助診斷，與核酸檢測(cè)手段相互補(bǔ)充，可彌補(bǔ)核酸檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)的假陰性和假陽性，以提高疑似病例檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

目前許多企業(yè)相繼推出了基于免疫學(xué)診斷的新冠病毒抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)試劑盒，抗體檢測(cè)試劑盒居多。中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第7版)》中增加了通過檢測(cè)新冠病毒蛋白特異性抗體檢測(cè)來輔助新冠肺炎的臨床診斷。

本文將對(duì)新冠病毒抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)的免疫分析方法重點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 免疫反應(yīng)

新型冠狀病毒入侵人體后，病毒本身攜帶的蛋白具有抗原活性，會(huì)刺激人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗體來抵抗病毒，先是抗體免疫球蛋白M(IgM)，然后會(huì)是抗體免疫球蛋白G(IgG)等。通過免疫分析技術(shù)可以檢測(cè)人體內(nèi)是否存在病毒攜帶的蛋白(抗原)和由于病毒入侵產(chǎn)生的抗體。

2.1 抗體檢測(cè)

在病毒入侵人體后，其相應(yīng)的抗原決定簇與淋巴細(xì)胞接觸將誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生特異性抗體，包括5類免疫球蛋白，分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

抗體檢測(cè)則是通過特定的抗原與待檢樣品中產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的抗體進(jìn)行檢測(cè)?；颊弑桓腥静《竞螽a(chǎn)生免疫反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生抗體。相關(guān)研究表明，通過對(duì)患者血液中IgM和IgG的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)COVID-19進(jìn)行診斷[5,6]。檢測(cè)包括了對(duì)血液中IgM和IgG單獨(dú)檢測(cè)和對(duì)兩者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)[7]。與核酸檢測(cè)相比，抗體檢測(cè)更適用于對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)呈陰性的疑似病例進(jìn)行補(bǔ)充檢測(cè)?？贵w檢測(cè)結(jié)果可幫助識(shí)別患者的感染情況：早期感染，IgM抗體呈現(xiàn)陽性；當(dāng)感染有一段時(shí)間，如超過7 d(或既往感染)，IgG抗體顯現(xiàn)陽性，一定時(shí)間范圍內(nèi)，其持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)含量越高[7,8]。

獲得可以識(shí)別抗體的抗原或抗抗體是抗體檢測(cè)的關(guān)鍵，通常使用重組蛋白技術(shù)。Zhang等[9]用2019-nCoV包膜蛋白E和核衣殼蛋白N作為抗原來對(duì)血清中IgM和IgG進(jìn)行免疫分析。由于冠狀病毒的核衣殼蛋白(NPs)具有高度的同源性， Zhou等[5]成功使用蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣殼蛋白(NP)作為抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)患者的IgG和IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)。Cai等[10]則從GenBank(NC_045512.1)基因組序列中推斷合成出20種肽被作為候選抗原，再通過免疫分析從中選擇合適的肽段，用于新冠病毒抗體檢測(cè)。重組抗原技術(shù)相對(duì)于抗體制備更容易，所以抗體檢測(cè)方法研發(fā)周期相對(duì)更短。

2.2 抗原檢測(cè)

抗原檢測(cè)是基于抗體與樣本中病毒攜帶的蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，通過對(duì)感染部位的取樣進(jìn)行免疫分析從而對(duì)COVID-19進(jìn)行判斷?？乖瓩z測(cè)的關(guān)鍵是制備適用于抗原檢測(cè)的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。大多數(shù)抗體必須利用免疫動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)獲得，制備過程相對(duì)繁瑣耗時(shí)。

新型冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的單條正鏈RNA病毒，同其他冠狀病毒一樣，SARS-CoV-2包含了核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)、刺突糖蛋白(Spike protein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)和膜蛋白(Membrane protein，M)[1,11]。S蛋白是該病毒入侵人體細(xì)胞的關(guān)鍵，通過S蛋白上的受體結(jié)合域(RBD)與宿主細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)產(chǎn)生特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[12]。Lei等[13]將ACE2的變體與人免疫球蛋白G進(jìn)行重組，所得到的融合蛋白可以與SARS-CoV-2結(jié)合。

SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白上的受體結(jié)合域具有相對(duì)較高的同源性，有研究發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV人單克隆抗體CR3022可以與SARS-CoV-2有效結(jié)合[14]。

可以與SARS-CoV-2有效結(jié)合的蛋白，具有被應(yīng)用于抗原檢測(cè)的潛力，對(duì)特異性抗體的制備具有非常重要的意義。此外，SARS-CoV-2的核衣殼蛋白(NPs)在所有7種冠狀病毒之間有非常高的同源性共享。Li 等[11]通過已報(bào)道的NP序列，利用小鼠和新西蘭兔制備了相應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體，用于SARS-CoV-2的抗原檢測(cè)。

2.3 抗體和抗原檢測(cè)試劑盒

不少企業(yè)相繼推出了基于免疫學(xué)分析的SARS-CoV-2抗原抗體檢測(cè)試劑盒，使用試劑盒可以使檢測(cè)過程更加簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)準(zhǔn)化?？乖贵w檢測(cè)試劑盒包括了IgG抗體檢測(cè)試劑盒、IgM抗體檢測(cè)試劑盒、IgG/IgM聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒以及抗原檢測(cè)試劑盒。

IgM與IgG的檢測(cè)有助于對(duì)病毒感染階段進(jìn)行判斷。研究發(fā)現(xiàn)測(cè)量IgG和IgM總抗體量具有比單獨(dú)測(cè)量單種抗體的測(cè)量結(jié)果具有更高的陽性率，減少了檢測(cè)過程中假陰性的概率[7]，IgM、IgG檢測(cè)可以顯示病毒感染的不同階段。而抗原試劑盒直接對(duì)感染部位病毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)，不同種類的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果可提供不同階段的有效信息。

截至2020年3月31日，中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局應(yīng)急審批新冠病毒檢測(cè)試劑產(chǎn)品25個(gè)，其中抗體檢測(cè)試劑盒8個(gè)。

3 免疫分析方法

不同廠家生產(chǎn)的抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)試劑盒用到的免疫分析方法不盡相同，有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)和磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)等。不同的分析方法可能用到不同的免疫分析方法、測(cè)量技術(shù)，從而造成檢測(cè)性能有所差別。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是最常用的一種免疫分析方法，將酶催化反應(yīng)與免疫反應(yīng)結(jié)合，包括了雙抗夾心法、兩位點(diǎn)一步法、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法；其原理是將酶分子與抗體(抗原)分子共價(jià)結(jié)合，然后將酶標(biāo)記的復(fù)合物與吸附在固相載體上的抗原或抗體接觸反應(yīng)，發(fā)生特異性結(jié)合，最后加入酶的反應(yīng)底物，根據(jù)底物的顏色反應(yīng)進(jìn)行定性和定量分析；其檢查結(jié)果可通過肉眼觀察顏色或使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度測(cè)量來判斷。SARS-CoV-2抗原抗體檢測(cè)主要用到雙抗原(體)夾心法、間接法和捕獲法[5,8,15]。

雙抗原夾心法進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，使用含有SARS-CoV-2的S蛋白的受體結(jié)合域的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組抗原與過氧化物(HRP)偶聯(lián)，用于和樣本中的目標(biāo)抗體結(jié)合，然后再與和固定相連接的抗原結(jié)合，最后在反應(yīng)體系中加入酶催化底物，底物的顏色反應(yīng)作為檢測(cè)結(jié)果[8]?？乖瓩z測(cè)時(shí)，只需將HRP偶聯(lián)抗原與固定相結(jié)合抗原換成可與病毒抗原結(jié)合的抗體，即雙抗體夾心法。

間接法主要用于抗體檢測(cè)，只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。捕獲法又稱反向間接法，多用于IgM的檢測(cè)，先將針對(duì)IgM的第二抗體包被與固相載體形成固相抗體；加入待測(cè)標(biāo)本時(shí)，其中IgM類抗體(特異和非特異的)即可被固相抗體捕獲；再加入特異性抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標(biāo)記特異性抗原的抗體，形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物；加底物顯色后，即可對(duì)待測(cè)標(biāo)本中IgM是否存在及含量進(jìn)行測(cè)定[8]。

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)特異性較強(qiáng)，不需要特殊的儀器就可以進(jìn)行定性檢測(cè)，通過酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度測(cè)量還可以在一定程度上進(jìn)行定量檢測(cè)；但是其人工操作步驟相對(duì)繁復(fù)，將影響整體的檢測(cè)速度[15]。

3.2 膠體金免疫技術(shù)

膠體金免疫技術(shù)利用金顆粒的高電子密度特性，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于免疫分析，膠體金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是將蛋白質(zhì)等高分子吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。

膠體金免疫技術(shù)包括有免疫膠體金光鏡染色法、免疫膠體金電鏡染色法、斑點(diǎn)免疫金滲濾法、膠體金免疫層析法。目前SARS-CoV-2抗體檢測(cè)試劑盒主要使用的方法為膠體金免疫層析技術(shù)[15]，包括已批準(zhǔn)的IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒。

膠體金免疫層析技術(shù)間接法檢測(cè)抗體過程如圖1所示，金標(biāo)墊上吸附有膠體金標(biāo)記的特異性抗原I,檢測(cè)區(qū)(T線)上固定的是特異性抗原Ⅱ，質(zhì)量控制區(qū)(C線)上固定有抗特異性抗原Ⅰ的抗體。樣品滴入樣品墊，待測(cè)抗體經(jīng)過金標(biāo)墊，形成的抗體-金標(biāo)記抗原在T線與抗原Ⅱ結(jié)合，游離的金標(biāo)記抗原Ⅰ繼續(xù)向前到達(dá)C線與抗抗體結(jié)合，最后T線和C線將發(fā)生不同程度的顏色變化?？乖瓩z測(cè)則將金標(biāo)記的抗原Ⅰ與檢測(cè)區(qū)固定的抗原Ⅱ換成可與病毒抗原結(jié)合的特異性抗體即可。該技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條的形式，使用十分方便。

圖1 膠體金免疫層析檢測(cè)抗體過程示意圖Fig.1 Colloidal gold immunochromatography detection process

在對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，使用靜脈全血、血清或血漿樣品與稀釋劑混合，直接添加到樣品墊，等待10～15 min，就可以通過測(cè)試條上測(cè)試線與對(duì)照線的顏色來判斷結(jié)果。測(cè)試條和對(duì)照線都變?yōu)榧t色為陽性；測(cè)試條不變色、對(duì)照條為紅色，則為陰性[15]。

膠體金免疫技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要額外的儀器便可進(jìn)行定性分析，可以對(duì)IgG和IgM進(jìn)行綜合檢測(cè)或單獨(dú)檢測(cè)；與操作相對(duì)繁瑣的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 相比更具優(yōu)勢(shì)，并且反應(yīng)迅速；但是這種技術(shù)的靈敏度比較差，無法進(jìn)行定量檢測(cè)。目前已有4個(gè)企業(yè)的膠體金免疫層析分析的試劑盒被應(yīng)急審批上市，適用于對(duì)臨床疑似病例進(jìn)行快速篩查，特別是對(duì)于無其他免疫分析所需要的配套檢測(cè)儀器的地方。

3.3 熒光免疫層析技術(shù)

熒光免疫層析技術(shù)采用熒光物質(zhì)作為示蹤標(biāo)記物，用于標(biāo)記特異性抗體(或抗原)，再與待測(cè)的抗原(或抗體)結(jié)合，通過熒光檢測(cè)儀檢測(cè)其特異性熒光反應(yīng)。根據(jù)熒光標(biāo)記物種類的不同可分為熒光素免疫熒光層析技術(shù)、量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)、上轉(zhuǎn)換納米粒子免疫層析技術(shù)。

熒光免疫層析技術(shù)的免疫反應(yīng)過程與膠體金免疫層析技術(shù)一樣，只是用熒光標(biāo)記物代替了膠體金進(jìn)行顏色反應(yīng)。與傳統(tǒng)膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)相比，熒光免疫層析技術(shù)通過儀器直接檢測(cè)激發(fā)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，這種檢測(cè)方式具有較高的靈敏度，有利于進(jìn)行準(zhǔn)確定量；并且與酶催化顯色技術(shù)相比，避免了催化效率及底物量限制的問題，具有更寬的檢測(cè)范圍。

熒光免疫層析技術(shù)相對(duì)于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和膠體金技術(shù)分辨率更高，檢測(cè)范圍更寬。雖然需要熒光分析儀進(jìn)行測(cè)量，但與磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)相比所需要的試劑成本和儀器成本更低，特別是上轉(zhuǎn)納米粒子免疫層析技術(shù)，使用時(shí)間分辨熒光分析儀，擁有接近化學(xué)發(fā)光的分辨率[7]，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。

3.4 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光與免疫技術(shù)結(jié)合，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吸收化學(xué)能從基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)釋放光能回到基態(tài)，發(fā)出的光子被發(fā)光信號(hào)檢測(cè)儀器接收從而對(duì)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量。化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)通過將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或催化化學(xué)物質(zhì)發(fā)光的酶標(biāo)記在抗原或抗體上，作為示蹤標(biāo)記物對(duì)抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)。

磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)綜合了磁微粒載體技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)。利用磁微粒作為固相載體，得到更高的比表面積，以及外加磁場(chǎng)的應(yīng)用，可獲得更高的靈敏度和更快的檢測(cè)速度。目前8個(gè)被批準(zhǔn)的抗體檢測(cè)試劑盒中有2個(gè)是應(yīng)用了磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)。

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)范圍寬，通過相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(PLV)來表征測(cè)量結(jié)果。目前已有比較成熟的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)快速測(cè)量，可以準(zhǔn)確地對(duì)IgG、IgM進(jìn)行區(qū)分測(cè)量，對(duì)患者IgG與IgM水平實(shí)現(xiàn)追蹤檢測(cè)，從而可以更加準(zhǔn)確地區(qū)分COVID-19與其他一些疾病。但是其試劑成本較高，需要借助特定的化學(xué)發(fā)光儀才能進(jìn)行測(cè)量，比較適用于重度感染地區(qū)的醫(yī)院、疾控機(jī)構(gòu)等有大量患者需要準(zhǔn)確定量檢測(cè)的地方[9]。

4 討論與展望

病毒的免疫診斷技術(shù)包括抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)，都是基于免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。抗原檢測(cè)需要制備與病毒蛋白特異性結(jié)合的抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)，常通過免疫動(dòng)物制備，制備過程比較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。抗體檢測(cè)需要可以與免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體相結(jié)合的抗原，而重組抗原的表達(dá)純化技術(shù)相對(duì)于抗體的免疫采集純化，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、時(shí)間周期相對(duì)較短；因此，目前研制成功的新冠病毒抗體檢測(cè)試劑盒的數(shù)量遠(yuǎn)多于其抗原檢測(cè)試劑盒，被批準(zhǔn)上市的免疫診斷試劑盒也都是抗體檢測(cè)試劑盒。但是，患病初期血清中沒有可檢測(cè)到的抗體，所以抗體檢測(cè)無法對(duì)該階段的感染者進(jìn)行篩查；這時(shí)想要通過免疫學(xué)方法篩查，需要使用抗原檢測(cè)，盡快研發(fā)并批準(zhǔn)可用于臨床診斷的抗原試劑盒變得非常重要。

表1給出了不同免疫分析方法的優(yōu)點(diǎn)及其局限性。

表1 不同免疫分析方法比較Tab.1 Comparison of different immunoassay methods

目前批準(zhǔn)的抗體檢測(cè)試劑盒，基于抗體的免疫學(xué)檢測(cè)存在假陽性情況，主要是由于內(nèi)源性干擾物質(zhì)，有相當(dāng)比例的標(biāo)本不同程度地含有內(nèi)源性(如嗜異性抗體、補(bǔ)體、溶菌酶)、外源性(如標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本凝固)的各種干擾物質(zhì)[11]，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的假陽性，因此檢測(cè)試劑盒質(zhì)量和檢測(cè)過程的質(zhì)量控制十分重要。新型冠狀病毒抗原抗體檢測(cè)試劑盒質(zhì)量，以及建立相關(guān)的免疫分析方法的可行性和測(cè)量結(jié)果的量值溯源，需要研制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行質(zhì)量控制。

目前，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院已研發(fā)了滿足病毒抗體和抗原檢測(cè)并具有溯源性計(jì)量意義的新型冠狀病毒人源IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和新型冠狀病毒核衣殼蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)抗原抗體檢測(cè)和產(chǎn)品的質(zhì)量控制起到重要支撐作用；同時(shí)，期望最終建立應(yīng)對(duì)生物安全威脅因子測(cè)量的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系。