小葉楊不同種源一年生扦插苗速生期表型性狀變異定量分析

葛會(huì)碩，宋躍朋，蘇雪輝，張德強(qiáng)，張曉宇

（1.北京林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；3.焦作市農(nóng)林科學(xué)研究院，河南 焦作 454001)

小葉楊Populus simonii具有控制土壤荒漠化、減少土壤侵蝕和穩(wěn)定沙丘的優(yōu)勢[1]。同時(shí)，小葉楊還具有較高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[2]。已有學(xué)者對(duì)小葉楊的生長特性，包括節(jié)間長度變量之間的關(guān)系和表型變異進(jìn)行分析[3]。節(jié)間長度是幼苗生長的重要指標(biāo)，節(jié)間長度變量間的關(guān)系對(duì)育種遺傳具有重要意義。2016 年，Yamamoto 等[4]基于圖像分析的機(jī)器學(xué)習(xí)方法探究了番茄Lycopersicon esculentum幼苗節(jié)間長度估計(jì)，能夠檢測到3 個(gè)番茄幼苗的時(shí)間序列圖像中358 個(gè)節(jié)點(diǎn)的72%。2017 年，李慧敏等[5]研究了玉蜀黍Zea mays穗下節(jié)間長度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與產(chǎn)量和抗倒伏性相關(guān)的農(nóng)藝性狀。2018 年，王健等[6]探討了普通小麥Triticum aestivum節(jié)間長度與株高的關(guān)系，結(jié)果表明矮稈小麥?zhǔn)峭ㄟ^縮短各節(jié)間長度來降低株高的。

在小葉楊的生長過程中，由于地理位置和生長環(huán)境的不同，小葉楊幼苗樣本可能具有不同的表型特征。沈德勝等[7]利用K-means 聚類方法提取了林木冠層孔隙度?？紤]到K-means 聚類對(duì)初始聚類中心敏感和易陷入局部最優(yōu)解，Wan 等[8]在K-means 聚類算法中引入了多種基于群體智能的優(yōu)化算法，發(fā)現(xiàn)人工蜂群算法（ABC）的搜索能力與粒子群算法相當(dāng)，前者收斂速度更快。所以采用基于人工蜂群算法的K-means 聚類（KABC）[9]可以有效防止陷入局部最優(yōu)，進(jìn)而達(dá)到準(zhǔn)確分類的效果。

由于表型變異是復(fù)雜遺傳多樣性的外在表現(xiàn)，所以是遺傳多樣性的重要研究領(lǐng)域之一[10]。陳美熹等[11]以馬尾松Pinus massoniana58 年生采種母樹林為研究材料發(fā)現(xiàn)母樹間在球果表型及種子性狀均存在極顯著差異。2010 年衛(wèi)尊征等[12]以東北和華北地區(qū)5 個(gè)種源的小葉楊為材料，分別對(duì)17 個(gè)表型及生理性狀進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)小葉楊各性狀在種源間和種源內(nèi)均存在廣泛的遺傳變異。2014 年，Du 等[3]研究了毛白楊Populus tomentosa的自然表型變異，發(fā)現(xiàn)各性狀在個(gè)體間存在著較大范圍的表型變異。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)節(jié)間長度的研究主要在農(nóng)作物方面，而林業(yè)上幼苗期的樹木節(jié)間長度直接反映了幼苗的生長狀況。此外，擴(kuò)大種源范圍對(duì)研究小葉楊種源間和種源內(nèi)遺傳變異具有重要意義。本文以小葉楊幼苗為研究材料，在2017 年4 月29 日至6 月17 日，對(duì)來自15 個(gè)種源的與生長、葉片和節(jié)間長度有關(guān)的性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析和遺傳變異分析，為幼苗的生長研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017 年，在北京林業(yè)大學(xué)科技溫室（40°0' N，116°20' E）共測量并記錄了77 株產(chǎn)自我國15 個(gè)種源地的小葉楊一年生扦插苗個(gè)體。種源地自然概況見表1。測定時(shí)間為小葉楊全生長季（從2017 年4 月29 日至6 月17日），使用同樣生理年齡的插穗進(jìn)行無性系擴(kuò)繁，每個(gè)系號(hào)4 次重復(fù)。即每隔15～ 20 d 利用直尺測量、記錄一次樣本生長的表型性狀，包括株高、葉片數(shù)、節(jié)數(shù)和節(jié)間長度，共測量和記錄4 次，其中節(jié)間長度是從地徑部分開始從下往上用直尺測量節(jié)與節(jié)之間長度。

表1 小葉楊種源地的地理位置與氣候條件Table 1 Location and climatic conditions of different provenances of P.simonii

1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

為了分析小葉楊幼苗節(jié)間長度之間的相關(guān)性和減少計(jì)算復(fù)雜度，借助R 語言軟件進(jìn)行因子分析，提取代表大部分特征的公因子（旋轉(zhuǎn)后的因子分析其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到65%以上即可）。在進(jìn)行因子分析之前，首先通過KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）檢驗(yàn)[13]是否適合做因子分析。KMO 檢驗(yàn)值在[0,1]區(qū)間。定義如下：

KMO 檢驗(yàn)值可以通過R 軟件中的psych 包（1.8.4 版）[14]進(jìn)行計(jì)算。

其次，基于Matlab 2016b 軟件，將3 個(gè)表型特征（株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)）和因子分析得到的公因子作為輸入值代入KABC 進(jìn)行聚類分析。參數(shù)設(shè)定：根據(jù)R 軟件MClust 包中的14 個(gè)指標(biāo)，確定最佳聚類數(shù) 。小葉楊的樣本集X＝(X1，X2，……XN)，N（樣本量）分別等于80，78，79 和77（4 個(gè)時(shí)期）。Xi(i＝1，2，……N)表示1*7 的向量（株高、葉片數(shù)、節(jié)數(shù)和4 個(gè)公共節(jié)間長因子）。種源大?。⊿N）為20，最大迭代次數(shù)為100，同一食物源（聚類中心）重復(fù)使用次數(shù)為10[9]。經(jīng)過人工蜂群算法的一次聚類中心的優(yōu)化結(jié)合K-means 聚類算法的一次聚類，交互進(jìn)行，直到算法收斂或達(dá)到最大迭代次數(shù)即輸出聚類中心（K×7）和聚類結(jié)果。通過聚類結(jié)果和聚類圖可以將不同地區(qū)的樣本進(jìn)行明確分類，以分析樣本和地區(qū)間的關(guān)系。

最后利用SPSS 21.0 軟件對(duì)小葉楊幼苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)以分析其變異性，試驗(yàn)測定其表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)CV和表型分化系數(shù)（Vst），以方差的百分比表示群體間的成分，并解釋了群體間和群體內(nèi)表型數(shù)據(jù)的分化程度。CV和Vst計(jì)算如下：

式中，σ(x)代表種源間樣本標(biāo)準(zhǔn)差，E(x)代表種源間樣本均值，代表種源間的方差分量，代表種源內(nèi)的方差分量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉楊幼苗節(jié)間長度性狀定量分析

經(jīng)計(jì)算，4 個(gè)時(shí)期（4 月29 日、5 月20 日、6 月4 日、6 月17 日）的KMO 值均屬于[0.7，0.8]區(qū)間，說明樣本數(shù)據(jù)適合做因子分析。分析計(jì)算公因子個(gè)數(shù)，結(jié)果如圖1。由圖1 表明，主成分分析（PCA）建議提取四個(gè)公因子；因子分析（EFA）建議提取三個(gè)公因子。從EFA 的結(jié)果來看，前四個(gè)特征值（三角形）在Scree 測試中高于拐點(diǎn)，因此，為了最大限度地保留原始數(shù)據(jù)信息，決定提取四個(gè)公因子（表2）。

由表2 可知，4 個(gè)時(shí)期的累計(jì)貢獻(xiàn)率為69.07%～76.69%，所以對(duì)應(yīng)的4 個(gè)公因子代表了原始數(shù)據(jù)的大部分信息。4 個(gè)時(shí)期因子分析載荷值明顯分為4 個(gè)區(qū)域，D 和C 部分的方差貢獻(xiàn)率在4 個(gè)時(shí)期均比B 和A部分高，說明D 和C 部分的幼苗生長速度較快。且每一個(gè)公因子都由相鄰節(jié)長變量組成（載荷較大），表明相鄰節(jié)長度具有較強(qiáng)的相似性。

圖1 評(píng)估因素?cái)?shù)量Figure 1 Number of assessment factors

表2 小葉楊4 個(gè)時(shí)期節(jié)間長度變量的因子分析Table 2 Factor analysis of internode length variables of P.simonii at 4 measurement days

2.2 小葉楊幼苗表型性狀聚類分析

首先利用R 軟件中mclust 包的14 個(gè)索引獲得推薦聚類結(jié)果，結(jié)果顯示BIC 值在4 個(gè)時(shí)期中值均為2。因此，確定最佳聚類數(shù)為2，如圖2。然后利用KABC 算法進(jìn)行迭代計(jì)算，最終得到了4 個(gè)時(shí)期內(nèi)小葉楊幼苗樣本的聚類結(jié)果，如圖3。

圖2 4 個(gè)日期的小葉楊幼苗推薦聚類數(shù)Figure 2 Recommended cluster number of P.simonii seedlings at 4 measurement date

圖3 KABC 算法對(duì)4 個(gè)時(shí)期小葉楊幼苗的分類結(jié)果Figure 3 Classification maps by KABC algorithms for P.simonii seedlings at 4 measurement dates

表3 4 月29 日和5 月20 日小葉楊幼苗平均株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)Table 3 Average height,number of leaf and internode of P.simonii seedlings on April 29th and May 20th

表4 6 月4 日和6 月17 日小葉楊幼苗平均株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)Table 4 Average height,number of leaf and internode of P.simonii seedlings on June 4th and June 17th

2.3 小葉楊幼苗不同種源間表型變異分析

由表5 可知，株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)3 個(gè)性狀種源間差異明顯。陜西麟游縣種源在株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)上指標(biāo)值均最大，平均海拔為1 271 m；陜西富縣株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)在種源間差異次之，平均海拔為1 200 m。對(duì)同在西北地區(qū)的青海省和寧夏回族自治區(qū)而言，寧夏中寧縣種源在株高性狀上差異均值僅略大于陜西麟游縣，平均海拔為2 955 m；貴德縣種源均值在株高和節(jié)數(shù)性狀上小于麟游縣，平均海拔為2 200 m，都蘭縣和興?？h種源在株高性狀上表現(xiàn)相似且均值均小于貴德縣，平均海拔分別為3 180 m 和3 924 m。整體表現(xiàn)為西北地區(qū)的這些種源株高較高和節(jié)數(shù)較多，隨著海拔升高，株高和節(jié)數(shù)值均降低。遼寧蓋州種源在株高和葉片數(shù)性狀上最小，表現(xiàn)為遼寧地區(qū)種源株高較矮，葉片數(shù)較少。

表5 小葉楊表型性狀的描述性統(tǒng)計(jì)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 5 Phenotypic traits of different provenances of P.simonii

小葉楊節(jié)長性狀在種源間也存在很大差異，遼寧蓋州種源中下部節(jié)長均值在種源間差異最大，但標(biāo)準(zhǔn)差差異最??；而西北地區(qū)陜西富縣、麟游縣和寧夏中寧縣種源中下部節(jié)長均值次之，標(biāo)準(zhǔn)差差異明顯；青海門源縣種源中下部節(jié)長標(biāo)準(zhǔn)差最大，表現(xiàn)為遼寧地區(qū)種源中下部節(jié)長種源間占植株比例波動(dòng)較小，位于西北地區(qū)的4個(gè)種源中下部節(jié)長占比差異較大。北京陶然亭公園種源中上部節(jié)長均值較大，平均海拔為43.5 m，河北赤城縣和內(nèi)蒙古包頭市種源次之，且赤城縣種源均值大于內(nèi)蒙古包頭市種源，兩地區(qū)平均海拔分別為945 m和2 000 m，表現(xiàn)為華北地區(qū)種源中上部節(jié)長占植株比例較大，隨著海拔的升高，中上部節(jié)長比例呈減小的趨勢。

2.4 小葉楊幼苗種源內(nèi)表型變異分析

從表6 可知，性狀變異都受地區(qū)差異影響，以葉片數(shù)變異系數(shù)波動(dòng)較小，中上部節(jié)長變異系數(shù)最大，中下部節(jié)長次之。株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)變異系數(shù)小于4 個(gè)節(jié)長公因子（下部節(jié)長、中下部節(jié)長、中上部節(jié)長和上部節(jié)長）變異系數(shù)，表明株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)性狀較穩(wěn)定，受較高的基因控制，4 個(gè)節(jié)長公因子穩(wěn)定性差，有較多變異可能性。

表6 小葉楊表型性狀的變異系數(shù)Table 6 Coefficient of variation of phenotypic traits of different provenances of P.simonii

對(duì)不同種源變異綜合分析可知，平均變異系數(shù)為6.09%～ 40.22%，變化幅度較大。其中西北地區(qū)寧夏中寧縣、青海門源縣和陜西麟游縣種源性狀變異系數(shù)較大，平均變異系數(shù)分別為40.22%，39.48%和38.18%。說明西北地區(qū)表型多樣性較豐富，遼寧蓋州縣平均變異系數(shù)最?。?.09%），表明東北地區(qū)種源多樣性較低。河北赤城縣、張家口和內(nèi)蒙古包頭市平均表型變異系數(shù)在22.65%～ 29.46%，波動(dòng)不大，三個(gè)地區(qū)年均降水量在400～421.8 mm，表明這些地區(qū)種源多樣性相似，與相似的氣候條件有關(guān)。

2.5 小葉楊幼苗種源間表型分化分析

由表7 可以看出，株高在種源內(nèi)方差分量較大，葉片數(shù)和節(jié)數(shù)次之且差異相似，4 個(gè)節(jié)長公因子分化幅度較小。各性狀分化幅度為6.9%～ 12.2%，其中株高的分化系數(shù)最大為12.2%，節(jié)數(shù)的分化系數(shù)也達(dá)到了11.9%，葉片數(shù)的分化系數(shù)最小為6.9%。各個(gè)性狀在種源內(nèi)的方差明顯大于種源間方差約4.56 倍，說明表型特征在種源內(nèi)變異大于種源間變異且主要來源于種源內(nèi)變異。7 個(gè)性狀的平均表型分化系數(shù)為17.6%，株高和節(jié)數(shù)性狀占較大比例，表明株高和節(jié)數(shù)在幼苗種源內(nèi)變異較大。

3 討論

目前對(duì)小葉楊幼苗節(jié)間長度性狀的分析尚未見報(bào)道，而節(jié)間長度也反映了幼苗的生長狀況，如王健等[6]探討了普通小麥節(jié)間長度與株高的關(guān)系，結(jié)果表明矮稈小麥?zhǔn)峭ㄟ^縮短各節(jié)間長度來降低株高的。所以通過探究小葉楊節(jié)間長度之間的關(guān)系可以得到影響幼苗生長的重要部位，由于試驗(yàn)得到4 個(gè)時(shí)期上部節(jié)長（D 部分）和中上部節(jié)長（C 部分）的方差貢獻(xiàn)率均比中下部節(jié)長（B 部分）和下部節(jié)長（A 部分）高，可推測這兩部分在幼苗生長中占據(jù)重要地位，對(duì)下一步群體基因組變異研究具有借鑒意義。

對(duì)小葉楊幼苗種源進(jìn)行表型性狀的變異分析發(fā)現(xiàn)，15 個(gè)種源的7 個(gè)性狀在種源內(nèi)和種源間均存在很大差異，且種源內(nèi)變異大于種源間變異，這與衛(wèi)尊征等[12]對(duì)小葉楊5 個(gè)群體的研究結(jié)果和Du 等[3]對(duì)毛白楊表型性狀的變異分析結(jié)論一致。這表明表型變異是小葉楊種源甚至楊屬Populus的普遍遺傳特性。這種形態(tài)特征的變異有利于小葉楊幼苗適應(yīng)環(huán)境，種源內(nèi)基因型的豐富性表現(xiàn)為表型性狀的多樣性，使種源能夠適應(yīng)不同的環(huán)境[16]，這也許造就了小葉楊生長優(yōu)良、壽命長、能在復(fù)雜氣候條件下生存的特點(diǎn)。

4 結(jié)論

對(duì)15 個(gè)種源小葉楊一年生幼苗表型性狀分析發(fā)現(xiàn)節(jié)間長度性狀間存在很大聯(lián)系，將23～ 26 個(gè)節(jié)長性狀提取為4 個(gè)公因子，將植株整體分為了4 部分，且每部分之間都存在較強(qiáng)的相關(guān)性，即由相鄰節(jié)長組成（載荷較大），說明幼苗相鄰節(jié)間長具有較穩(wěn)定的遺傳特征。4 個(gè)時(shí)期上部節(jié)長（D 部分）和中上部節(jié)長（C 部分）的方差貢獻(xiàn)率均比中下部節(jié)長（B 部分）和下部節(jié)長（A 部分）高，說明幼苗D 和C 部分形態(tài)特征變化較大，這與植株自身生長情況相符。

通過對(duì)小葉楊幼苗均值和標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)結(jié)果得到西北地區(qū)種源株高較高和節(jié)數(shù)較多，隨著海拔升高，株高和節(jié)數(shù)值均降低；遼寧蓋州種源在株高和葉片數(shù)最小，表現(xiàn)為遼寧地區(qū)種源株高較矮，葉片數(shù)較少。此結(jié)果和文中KABC 聚類算法得到的結(jié)果相同，聚類結(jié)果中第二類樣本主要分布在西北的陜西、青海和寧夏等地，平均株高、平均葉片數(shù)和平均節(jié)數(shù)值在4 個(gè)時(shí)期明顯比第一類樣本大。

研究結(jié)果也表明，小葉楊幼苗種內(nèi)也存在極其豐富的種源間和種源內(nèi)變異，15 個(gè)種源幼苗的7 個(gè)表型性狀平均變異系數(shù)在6.09%～ 40.22%，變異幅度較大，其中以中上部節(jié)長度變異系數(shù)最大，株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)變異小于4 個(gè)節(jié)長公因子變異系數(shù)，表明株高、葉片數(shù)和節(jié)數(shù)性狀受較高的基因控制，4 個(gè)節(jié)長公因子變異較豐富。其次，7 個(gè)表型性狀分化幅度為6.9%～ 12.2%，株高的分化系數(shù)最大為12.2%，各個(gè)性狀在種源內(nèi)的方差分量明顯大于種源間方差分量，說明表型性狀在種源內(nèi)變異大于種源間變異，即種源內(nèi)的多樣性程度大于種源間的多樣性程度。