一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定小兒止嗽金丹中6種成分含量

劉香葉，趙賽，朱月梅

淮安市第一人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223001

小兒止嗽金丹由炒杏仁、桔梗、玄參、知母、麥冬、竹茹、炒紫蘇子等15味中藥加工而成，具有解熱潤(rùn)肺、化痰止嗽的作用，用于外感風(fēng)熱引起的咳嗽痰盛、口干舌燥、腹?jié)M便秘等癥狀的治療。小兒止嗽金丹現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊(cè)，其中未收載任何成分定量檢測(cè)方法[1]，也未檢索到對(duì)該制劑所含1種或多組分定量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。中藥及其復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，單一成分難以全面評(píng)價(jià)該產(chǎn)品質(zhì)量，多組分質(zhì)量控制模式已逐步應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑中，一測(cè)多評(píng)法(QAMS)利用中藥組分間存在的一定內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過(guò)測(cè)定1個(gè)對(duì)照品質(zhì)量穩(wěn)定、價(jià)格低廉的組分，建立其與其他成分的相對(duì)校正因子，達(dá)到對(duì)該制劑所含多個(gè)組分的同時(shí)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)以苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷為檢測(cè)指標(biāo)，選取哈巴苷為內(nèi)參物，建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)檢測(cè)小兒止嗽金丹中6種活性成分含量，將一測(cè)多評(píng)檢測(cè)結(jié)果與外標(biāo)法對(duì)比，考察一測(cè)多評(píng)法的可行性及準(zhǔn)確性，為全面評(píng)價(jià)小兒止嗽金丹的產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010C型島津高效液相色譜儀；UltiMate3000型高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；XSE205DU型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào)：111730-201709，CAS號(hào)：19210-12-9，純度：95.9%)、哈巴苷對(duì)照品(批號(hào)：111729-201707，CAS號(hào)：6926-08-5，純度：96.8%)、苦杏仁苷對(duì)照品(批號(hào)：110820-201808，CAS號(hào)：29883-15-6，純度：88.2%)均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；去芹糖桔梗皂苷E對(duì)照品(批號(hào)：PRF8032746，CAS號(hào)：849758-42-5，純度：98.5%)來(lái)源于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；桔梗皂苷E對(duì)照品(批號(hào)：18030721，CAS號(hào)：237068-41-6，純度：98.5%)、桔梗皂苷D3對(duì)照品(批號(hào)：18050126，CAS號(hào)：67884-03-1，純度：98.6%)均來(lái)源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

小兒止嗽金丹(承德新愛(ài)民制藥有限公司，規(guī)格：每袋裝0.6 g，批號(hào)分別為：180906、190201、190302、190310、190313；山西正元盛邦制藥有限公司，批號(hào)分別為：180714、181014、181023、181130、181204)；乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷對(duì)照品適量，加60%甲醇溶解并制成每1 mL含苦杏仁苷4.318 mg、去芹糖桔梗皂苷E 0.156 mg、桔梗皂苷E 0.332 mg、桔梗皂苷D30.128 mg、哈巴苷0.972 mg、哈巴俄苷0.354 mg的單成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密吸取上述儲(chǔ)備液2.5 mL，置50 mL量瓶中，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液 取小兒止嗽金丹適量，混勻，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷至室溫，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3陰性樣品溶液 按照小兒止嗽金丹的工藝處方，制備缺炒杏仁、缺桔梗和缺玄參的陰性樣品，再按2.1.2項(xiàng)下方法制備3種陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

采用Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12.0 min，6.0%A；12.0～20.0 min，6.0%～10.0%A；20.0～37.0 min，10.0%～32.0%A；37.0～52.0 min，32.0%～58.0%A；52.0～60.0 min，58.0%～6.0%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm[2-6]；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取2.1.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液及2.1.2、2.1.3項(xiàng)下制備的溶液各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)定成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按所測(cè)定成分色譜峰計(jì)均不低于4500，陰性樣品無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖 1。

注：A.混合對(duì)照品；B.小兒止嗽金丹；C.炒杏仁陰性樣品；D.桔梗陰性樣品；E玄參陰性樣品；1.苦杏仁苷；2.去芹糖桔梗皂苷E；3.桔梗皂苷E；4.桔梗皂苷D3；5.哈巴苷；6.哈巴俄苷。圖1 混合對(duì)照品、小兒止嗽金丹、炒杏仁陰性樣品、桔梗陰性樣品和玄參陰性樣品HPLC圖

2.4 QAMS方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下單成分對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，置于20 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液Ⅰ，再依次精密吸取混合對(duì)照品溶液Ⅰ各適量，依次用60%甲醇稀釋2、4、8、16、20倍，制成混合對(duì)照品溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ，依次精密吸取混合對(duì)照品溶液Ⅵ～Ⅰ各適量，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，以所測(cè)各成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，在2.2項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的峰面積，結(jié)果這6個(gè)成分峰面積的RSD分別為0.63%、1.06%、1.17%、1.30%、0.86%和1.25%。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次小兒止嗽金丹樣品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，再按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的含量，結(jié)果所測(cè)成分含量的RSD分別為1.07%、1.77%、1.59%、0.93%、1.24%和1.66%。

表1 小兒止嗽金丹6個(gè)成分線性關(guān)系結(jié)果

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷6個(gè)對(duì)照品各適量，制成混合對(duì)照品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷對(duì)照品峰面積的RSD分別為0.69%、1.10%、1.21%、1.28%、0.78%和1.32%；取同一批次小兒止嗽金丹供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果供試品溶液中苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.83%、0.98%、1.20%、1.37%、0.74%和1.29%，表明混合對(duì)照品溶液和小兒止嗽金丹供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的小兒止嗽金丹適量，混勻，取9份，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入加標(biāo)對(duì)照品溶液(苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別為1.276、0.048、0.086、0.034、0.296、0.092 mg·mL-1)各1.0 mL(3份)、2.0 mL(3份)、3.0 mL(3份)，按照2.1.2項(xiàng)下的方法制備加樣樣品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果所測(cè)成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的平均加樣回收率分別為99.85%、97.88%、98.10%、96.95%、100.13%、98.66%，RSD分別為0.69%、1.41%、1.51%、1.06%、0.73%、0.89%(n=9)。

2.5 相對(duì)校正因子的計(jì)算

2.5.1相對(duì)校正因子的測(cè)定 在2.2項(xiàng)色譜條件下，取2.4.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液Ⅵ～Ⅰ，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰峰面積。以哈巴苷為內(nèi)參物，按公式(1)計(jì)算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表2。

內(nèi)/待=內(nèi)/待=(A內(nèi)c待)/(A待c內(nèi))

(1)

式中A內(nèi)為內(nèi)參物哈巴苷的峰面積，c內(nèi)為內(nèi)參物哈巴苷的質(zhì)量濃度，A待為待測(cè)成分的峰面積，c待為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度。

2.5.2待測(cè)組分色譜峰的定位 采用相對(duì)保留時(shí)間法對(duì)待測(cè)成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰進(jìn)行定位，以內(nèi)參物哈巴苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，考察2個(gè)品牌的高效液相色譜儀：LC-2010C型及UltiMate3000型和3種色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsi C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)條件下，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷與哈巴苷的相對(duì)保留時(shí)間值，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.3不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 考察了2個(gè)品牌的高效液相色譜儀：LC-2010C型及UltiMate3000型和3種色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsi C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)相對(duì)校正因子值的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，不同品牌檢測(cè)儀器和不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子值無(wú)顯著影響。

表2 以哈巴苷為內(nèi)參物的5個(gè)成分的f值

表3 小兒止嗽金丹6個(gè)成分相對(duì)保留時(shí)間

表4 不同色譜儀和不同色譜柱對(duì)f值的影響

2.5.4不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 分別考察了不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)對(duì)相對(duì)校正因子值的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的比較

取10個(gè)批次的小兒止嗽金丹樣品適量，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，每個(gè)批次平行制備3份，在2.2項(xiàng)色譜條件下，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，用外標(biāo)法計(jì)算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的含量；并根據(jù)苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的相對(duì)校正因子值，計(jì)算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的含量。比較一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法所測(cè)結(jié)果，2種方法所測(cè)結(jié)果的偏差(RAD)均小于2.0%，表明一測(cè)多評(píng)法用于小兒止嗽金丹的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 不同流速對(duì)f值的影響

表6 小兒止嗽金丹6種成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

注：ESM為外標(biāo)法；QAMS為一測(cè)多評(píng)法。

3 討論

3.1 待測(cè)指標(biāo)成分的選擇

小兒止嗽金丹由炒杏仁、桔梗、玄參、知母、麥冬、竹茹、炒紫蘇子等15味中藥組方而成，方中玄參、麥冬清熱潤(rùn)肺、滋陰生津，為方中君藥；膽南星(酒蒸)、竹茹、川貝母、天花粉、知母清熱化痰，杏仁(炒)、紫蘇子(炒)、瓜蔞子止咳平喘，為方中臣藥；佐以紫蘇葉解表散寒，桔梗宣肺利咽，桑白皮瀉肺平喘，檳榔(炒)消積行氣；甘草祛痰止咳，調(diào)和諸藥，為方中使藥，諸藥合奏，共達(dá)解熱潤(rùn)肺、化痰止嗽的功效。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物的確定原則，選取小兒止嗽金丹方中君藥玄參所含標(biāo)志性成分哈巴苷、哈巴俄苷，臣藥炒杏仁所含代表性成分苦杏仁苷以及佐藥桔梗所含主要成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3為定量測(cè)定指標(biāo)，采用一測(cè)多評(píng)法實(shí)現(xiàn)對(duì)小兒止嗽金丹中多組分的同時(shí)測(cè)定。

3.2 色譜條件的考察

分別以乙腈-水系統(tǒng)[4]和甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，個(gè)別峰峰形不好，有拖尾現(xiàn)象，分離效果不好；乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，部分峰有拖尾現(xiàn)象，為使峰變得尖銳，考慮向水相中加入適量濃度的磷酸溶液[2，5-7]，通過(guò)對(duì)磷酸溶液濃度及流動(dòng)相比例的不斷摸索，最終確定以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，按照文中2.2項(xiàng)下梯度洗脫比例對(duì)小兒止嗽金丹中所含苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，在此條件下，待測(cè)成分色譜峰峰形尖銳，各組分間的分離度符合要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小兒止嗽金丹所含主要成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的同時(shí)測(cè)定，所建立的方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，為評(píng)價(jià)小兒止嗽金丹的內(nèi)在質(zhì)量提供了參考。