不同栽培方式 產(chǎn)地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異分析△

田文倉(cāng)，馮紫薇，石福娟，石玥，張靖晗，丁一明， 欒震，宋學(xué)武，趙婷，4*，魏勝利，4*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.子洲縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展投資有限公司，陜西 榆林 718400；3.中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì) 藥具管理中心，北京 102488；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102

黃芪為臨床常用的大宗藥材，來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。筆者前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)目前市場(chǎng)流通的黃芪商品主要為蒙古黃芪，而膜莢黃芪較少，由此可見蒙古黃芪是藥用黃芪的主要來源。蒙古黃芪分布范圍極廣，根據(jù)詹志來等[2]及筆者實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)蒙古黃芪現(xiàn)在主要分布于甘肅、內(nèi)蒙、山西、陜西、寧夏等地。這些產(chǎn)地之間地理位置跨度大，環(huán)境迥異且各地長(zhǎng)期以來形成了本地特有的黃芪栽培方式及產(chǎn)地加工技術(shù)，因此所產(chǎn)黃芪藥材質(zhì)量參差不齊[3-5]。皂苷類(黃芪甲苷)和黃酮類成分是黃芪藥效成分的主要組成部分。研究表明黃芪甲苷具有抗炎、抑制腫瘤、保護(hù)肝損傷等作用[6-7]，黃芪中黃酮類成分具有抗氧化、抗病毒、抑制黑色素生成等作用[8]。因此研究以采自33個(gè)蒙古黃芪主產(chǎn)地的蒙古黃芪藥材為研究材料，以黃芪甲苷和總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同栽培方式和不同產(chǎn)地蒙古黃芪進(jìn)行差異分析，進(jìn)而分析差異形成原因，以期為栽培、選購(gòu)優(yōu)質(zhì)黃芪藥材提供理論依據(jù)。

1 材料

Waters ACQUITY-UPLC-TUV-ELS型高效液相色譜儀；AL204型電子分析天平(d=0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器有限公司)；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1700PC紫外-可見分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)。

黃芪甲苷(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)141209，純度：99.45%)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：160120，純度：99.2%)；乙腈[色譜純,CAS:75-05-8，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；甲醇(分析純，批號(hào)：20181125，北京化工廠)；乙醇(分析純，批號(hào)：20181211，北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

所用的樣品為課題組在2018年9—11月采集的33批蒙古黃芪藥材，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院魏勝利教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的根，憑證標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源樣品庫(kù)，樣品信息見表1。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備

黃芪甲苷對(duì)照品溶液的配制：精密稱取黃芪甲苷(105 ℃烘至恒重)對(duì)照品適量，70%甲醇定容制成質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液的配制：精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(105 ℃烘至恒重)2.96 mg，用75%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，即得0.059 2 mg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

表1 試驗(yàn)樣品信息

2.2 供試品溶液制備

黃芪甲苷含量測(cè)定的供試品溶液制備：精密稱取藥材粉末2.0 g，置50 mL離心管中，加甲醇30 mL，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，2000 r·min-1離心(離心半徑為3 cm)5 min，取上清液。殘?jiān)偌蛹状?0 mL，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，2000 r·min-1離心(離心半徑為3 cm)5 min，取上清液。合并上清液，蒸干。殘?jiān)?0%(V/V)氨水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，即得。

總黃酮含量測(cè)定的供試品溶液制備：精密稱取黃芪藥材粉末0.5 g，加25 mL 75%乙醇，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，濾過，適量75%乙醇洗滌濾渣，合并濾液并定容至50 mL，從中精密量取2.0 mL溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，再用75%乙醇定容，即得。

2.3 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水-乙腈(68∶3)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；氮?dú)饬魉伲? L·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，黃芪甲苷對(duì)照品、樣品色譜圖見圖1。

注：A.黃芪甲苷對(duì)照品；B.供試品。圖1 黃芪甲苷對(duì)照品及供試品色譜圖

2.4 總黃酮測(cè)定光譜條件

以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為對(duì)照品，在260 nm下測(cè)定對(duì)照品及樣品吸光度值。對(duì)照品及樣品光譜圖見圖2。

注：A.對(duì)照品；B.供試品。圖2 對(duì)照品及供試品光譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μL分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以黃芪甲苷的進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=1.481 2X+16.045，r=0.999 4。結(jié)果表明黃芪甲苷的進(jìn)樣量在0.75～18.755 μg線性關(guān)系良好。

精密量取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL置25 mL容量瓶中，75%乙醇定容。以75%乙醇作為空白，分別取適量不同濃度對(duì)照品溶液，在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y= 56.794X+0.001 9，r=0.999 9。結(jié)果表明總黃酮進(jìn)樣量在0.059 2～0.473 6 mg線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，求得RSD為1.37%，表明儀器精密度良好。

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液適量，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得吸光度。求得RSD為0.09%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 平行精密稱取同一樣品6份，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.04 mg·g-1，RSD為2.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

平行精密稱取同一樣品6份，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為4.79 mg·g-1，RSD為0.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得黃芪甲苷含量RSD為1.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

取同一供試品溶液，分別于配置后0、2、5、8、20 h測(cè)定吸光度值，測(cè)得黃酮含量RSD為1.59%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5回收率試驗(yàn) 精密稱取已知黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1.04 mg·g-1)的同一批樣品約2 g，共6份，精密加入黃芪甲苷對(duì)照品(0.192 mg·mL-1)各5 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 黃芪甲苷測(cè)定的加樣回收率(n=6)

精密稱取已知總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(4.296 mg·g-1)的同一批樣品約0.5 g，共6份，分別置50 mL具塞錐形瓶中，再分別精密加入毛蕊異黃酮苷對(duì)照品溶液(0.059 2 mg·mL-1)25 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 總黃酮測(cè)定的加樣回收率(n=6)

2.5.6樣品測(cè)定 33批樣品分別平行取3份，按上述2種方法分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel software 2010及SPSS 19.0進(jìn)行分析。采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)Duncan′s進(jìn)行多因素檢驗(yàn)，其中P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地、栽培方式蒙古黃芪黃芪甲苷及總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

不同產(chǎn)地、栽培方式蒙古黃芪黃芪甲苷、總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地、栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷和 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

3.2 不同栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析

蒙古黃芪有育苗移栽和種子直播2種栽培方式。全國(guó)大多數(shù)產(chǎn)區(qū)普遍采用育苗移栽的栽培方式，一般育苗1年后，再移栽生長(zhǎng)1年即可采收，所產(chǎn)黃芪是市場(chǎng)主流產(chǎn)品。種子直播方式只在山西渾源、陜西子洲及其周邊地區(qū)采用，直播黃芪一般生長(zhǎng)5年或5年以上才可采收。對(duì)2種栽培方式下的蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明2種栽培方式下的黃芪甲苷含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。種子直播蒙古黃芪中黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.245%，為育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.151%)的1.6倍。而2種栽培方式下的總黃酮含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，種子直播蒙古黃芪藥材總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.541%，育苗移栽蒙古黃芪總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.508%。

3.3 不同產(chǎn)地蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析

3.3.1不同產(chǎn)地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析 通過對(duì)不同產(chǎn)地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量測(cè)定及分析，結(jié)果表明，各產(chǎn)地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷含量和總黃酮含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到0.323%，為最低值(0.061%)的5倍?？傸S酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到0.903%，為最低值(0.376%)的2.4倍。

3.3.2不同產(chǎn)地種子直播蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析 通過對(duì)不同產(chǎn)地種子直播蒙古黃芪藥材的黃芪甲苷和總黃酮含量測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中黃芪甲苷含量最高的藥材來源于陜西省子洲縣西莊鄉(xiāng)(0.343%)，是質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的陜西省佳縣(0.161%)的2.13倍?？傸S酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的樣品來源于陜西省府谷縣，高達(dá)0.825%，為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的陜西省子洲縣三川口(0.399%)的2.07倍。

4 結(jié)論與討論

4.1 不同栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總黃酮含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果表明采用種子直播所生產(chǎn)的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量相對(duì)高于育苗移栽所產(chǎn)蒙古黃芪的，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由樣品信息可知，種子直播黃芪生長(zhǎng)年限一般為5年，有些甚至5年以上，而育苗移栽黃芪生長(zhǎng)年限為2年，因此上述差異可能是由于生長(zhǎng)年限長(zhǎng)導(dǎo)致，而非僅僅是種植方式的不同導(dǎo)致。研究表明黃芪甲苷會(huì)隨著生長(zhǎng)年限有先升后降的變化趨勢(shì)，降低的轉(zhuǎn)折點(diǎn)在5年或6年[9]，因此5年生黃芪藥材黃芪甲苷含量一般是高于2年生黃芪藥材。2種栽培方式下總黃酮含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與劉鳳波[10]的研究結(jié)果一致。

本研究考察的是不同栽培方式對(duì)黃芪藥材黃芪甲苷和總黃酮含量的影響，但由于受時(shí)間及空間的限制，未能保證除栽培方式以外其他因素完全一致，這也是目前這類研究[11-12]存在的普遍問題，因此對(duì)于考察栽培方式的影響還有待更加科學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來完成。

4.2 不同產(chǎn)地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異明顯

產(chǎn)地是道地藥材形成的原因之一，而產(chǎn)地對(duì)藥材的影響是與其所在地的環(huán)境因子是緊密相關(guān)的。結(jié)果表明，不論是育苗移栽種植還是種子直播種植，不同產(chǎn)地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在種植或選購(gòu)優(yōu)質(zhì)黃芪藥材時(shí)要充分考慮產(chǎn)地因素，從結(jié)果看，選擇黃芪甲苷含量較高的黃芪應(yīng)該選擇山西渾源或陜西子洲產(chǎn)的種子直播黃芪，選擇總黃酮含量較高的黃芪則選擇寧夏固原的育苗移栽黃芪更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。