蘇龍嘎-4顆?？寡?鎮(zhèn)痛 止瀉的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究△

陳影，蘇萍，張廣平，張海靜，楊依霏，陳騰飛，馬麗娜， 侯紅平，高云航，李晗，張鐘秀，葉祖光*

1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100075

腹瀉可導(dǎo)致人和動(dòng)物腸道正常菌群失調(diào)、吸收障礙、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能降低，是引起兒童患病和死亡的第二大病因[1]。蒙醫(yī)藥是我國(guó)少數(shù)民族醫(yī)藥之一，是內(nèi)蒙古自治區(qū)區(qū)醫(yī)療事業(yè)的特色與優(yōu)勢(shì)[2]。蒙醫(yī)將小兒腹瀉分為寒熱兩型病，熱瀉是由于熱、銳性外因致小兒三根失調(diào)，齊蘇和希拉之熱偏盛下注腸腑而引起[3]。蒙藥蘇龍嘎-4湯為臨床治療小兒熱瀉的常用驗(yàn)方，出于《蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗(yàn)方》，引自《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》[4-5]。蘇龍嘎-4顆粒是從蘇龍嘎-4湯的基礎(chǔ)上發(fā)展出的1種新劑型，與湯劑相比，顆粒劑體積小，易攜帶、儲(chǔ)藏及運(yùn)輸，不易變質(zhì)且口感好，患者依從性高，比湯劑更受醫(yī)患?xì)g迎。蘇龍嘎-4顆粒由連翹、拳參、木通和麥冬4味藥配伍組成，性涼，具有清熱燥濕之功效，主治大小腸之熱、腸刺痛、痢疾、熱瀉等[6]。該方中連翹為主藥，用于腑熱、腸刺熱、熱瀉[7]；配合麥冬清熱-抑希拉的效果；木通清腑中之熱；拳參解毒、止瀉，對(duì)大小腸等腑器熱癥有特效[8]。本研究通過評(píng)價(jià)蘇龍嘎-4顆粒澀腸、止瀉、抗炎和鎮(zhèn)痛等方面的作用，以期為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠(16～18 g)和SPF級(jí)昆明種小鼠(16～18 g)，雌雄各半，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF動(dòng)物房，屏障系統(tǒng)，人工光照，12 h明暗周期，溫度控制在20～26 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，換氣次數(shù)不少于15次/h。適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

蘇龍嘎-4顆粒(內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司，批號(hào)：190411，純度：2.454 g·g-1)；活性炭(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20190103)；阿拉伯膠(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2019040191)；蓖麻油(河南省華龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20181103)；硫酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190220)；番瀉葉(北京同仁堂藥店，批號(hào)：180104002)；二甲苯(北京化工廠，批號(hào)：20171016)；冰乙酸(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10107172)；洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：181018267)；腸炎寧片(江西康恩貝中藥有限公司，批號(hào)：1809011)；阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：1806211)；0.9%氯化鈉溶液(山東華魯制藥有限公司，批號(hào)：13116040408)。

1.3 儀器

ME204E型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；102中速定性濾紙；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；串籠；直徑7 mm打孔器；HW.SY21-KP4型智能恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)。

2 方法

2.1 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

2.1.1正常小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組：空白組、陽性組(洛哌丁胺)、蘇龍嘎-4顆粒各劑量組(0.16、0.33、0.65、1.30 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半。空白組灌胃給予去離子水，陽性組灌胃給予洛哌丁胺(0.002 g·kg-1)，蘇龍嘎-4顆粒各受試藥組分別灌胃給予相應(yīng)濃度受試藥液。各組動(dòng)物灌胃容積均為20 mL·kg-1，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，末次給藥30 min后，各組動(dòng)物每只給予5%炭末混懸液(用10%阿拉伯膠溶液配制)0.2 mL。20 min后脫頸處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取從幽門至回盲腸的腸管，置于鋪有0.9%氯化鈉溶液的托盤上，將小腸不加牽引輕輕擺成直線，測(cè)量幽門到回盲腸的長(zhǎng)度，作為小腸全長(zhǎng)，再測(cè)量幽門至炭末前沿長(zhǎng)度記錄為炭末推進(jìn)距離，并計(jì)算炭末推進(jìn)率[9-10]。

炭末推進(jìn)率=炭末推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng)×100%

(1)

2.1.2蓖麻油所致腹瀉小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠70只，隨機(jī)分為7組：空白組、模型組、陽性組(洛哌丁胺)、蘇龍嘎-4顆粒各劑量組(0.16、0.33、0.65、1.30 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半，空白組和模型組灌胃給予去離子水，陽性組灌胃給予洛哌丁胺(0.002 g·kg-1)，蘇龍嘎-4顆粒各受試藥組分別灌胃給予相應(yīng)濃度受試藥液。各組動(dòng)物灌胃容積均為20 mL·kg-1，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，末次給藥20 min后，除空白組外，其余各組動(dòng)物每只給予蓖麻油0.3 mL，30 min后各組動(dòng)物每只給予5%炭末(用10%阿拉伯膠溶液配制)混懸液0.2 mL[11]。動(dòng)物處理同2.1.1。

2.2 止瀉實(shí)驗(yàn)

2.2.1蓖麻油致小鼠腹瀉的止瀉實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。動(dòng)物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前12 h各組動(dòng)物禁食不禁水，末次給藥后30 min，除空白組外，其余各組動(dòng)物每只灌胃給予蓖麻油原液0.3 mL[12]。

2.2.2硫酸鎂致小鼠腹瀉的止瀉實(shí)驗(yàn) 除造模劑為15%的硫酸鎂，每只動(dòng)物灌胃容積為0.4 mL外，其余操作同2.2.1。

2.2.3番瀉葉致小鼠腹瀉的止瀉實(shí)驗(yàn) 除造模劑為20%的番瀉葉，每只動(dòng)物灌胃容積為0.5 mL外，其余操作同2.2.1。

2.2.4療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 造模后小鼠單籠飼養(yǎng)，籠底放置濾紙供收集糞便和計(jì)數(shù)使用，1 h更換濾紙1次。觀察小鼠腹瀉潛伏期及6 h內(nèi)小鼠的累積稀便數(shù)，并統(tǒng)計(jì)計(jì)算稀便抑制率[13]。

稀便抑制率=(模型組平均稀便數(shù)-給藥組 平均稀便數(shù))/模型組平均稀便數(shù)×100%

(2)

小鼠大便分為5種：正常便；外型正常但含水分多的軟便；外型不正常的軟便；水樣便；黏液便。將前2種視為正常便，后3種視為腹瀉便[14]。

2.3 抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.3.1抗炎實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。除陽性組為阿司匹林(0.26 g·kg-1)外，動(dòng)物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。末次給藥30 min后，空白組小鼠用移液槍在右耳兩面涂20 μL 0.9%氯化鈉溶液，其余各組小鼠右耳涂以20 μL 100%二甲苯致炎，左耳不做處理。30 min后將小鼠脫頸處死，用直徑7 mm規(guī)格的打孔器在左右兩耳相同部位打下耳片，于電子天平上分別稱取兩耳片的濕質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量之差作為炎癥腫脹度觀察指標(biāo)，并計(jì)算耳腫脹率和抑制率[15-16]。

耳腫脹率=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/ 左耳質(zhì)量×100%

(3)

抑制率=(模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均 腫脹度)/模型對(duì)照組平均腫脹度×100%

(4)

2.3.2鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。除陽性組為腸炎寧(0.90 g·kg-1)外，動(dòng)物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。于末次給藥1 h后，空白組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，其余各組小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液10 mL·kg-1，注射后，立即放入透明觀察箱中，觀察并記錄小鼠扭體潛伏期和20 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)。取各給藥組的扭體次數(shù)與模型組平均扭體次數(shù)比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。觀察標(biāo)準(zhǔn)：腹腔內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高[17-18]。

扭體抑制率=(模型組平均扭體次數(shù)-給藥組平均 扭體次數(shù))/模型組平均扭體次數(shù)×100%

(5)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響

3.1.1對(duì)正常小鼠小腸推進(jìn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.33、1.30 g·kg-1劑量組對(duì)小腸推進(jìn)均具有抑制作用(P<0.05，P<0.01)，洛哌丁胺組對(duì)小腸推進(jìn)具有顯著抑制作用(P<0.01)，各組小鼠的炭末推進(jìn)距離和炭末推進(jìn)率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)正常小鼠腸推進(jìn) 運(yùn)動(dòng)的影響

注：空白組比較*P<0.05，**P<0.01； —表示該項(xiàng)無內(nèi)容。

3.1.2對(duì)蓖麻油致腹瀉小鼠小腸推進(jìn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組相比，模型組炭末推進(jìn)距離與推進(jìn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，說明蓖麻油對(duì)小腸蠕動(dòng)有促進(jìn)作用。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒除最低劑量組外其余各組對(duì)小腸推進(jìn)均具有抑制作用(P<0.01，P<0.001)，洛哌丁胺組對(duì)小腸推進(jìn)具有顯著抑制作用(P<0.001)，各組小鼠的炭末推進(jìn)距離和炭末推進(jìn)率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)蓖麻油致腹瀉小鼠腸 推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響

注：空白組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001； —代表該項(xiàng)無內(nèi)容，下同。

3.2 對(duì)藥物性腹瀉影響

3.2.1對(duì)蓖麻油致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.65、1.30 g·kg-1劑量組初次腹瀉時(shí)間明顯延遲(P<0.01，P<0.001)；洛哌丁胺組稀便數(shù)顯著降低(P<0.05)，蘇龍嘎-4顆粒各劑量組稀便數(shù)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉有抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3。

表3 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)蓖麻油致小鼠 腹瀉的影響

3.2.2對(duì)硫酸鎂致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒1.30 g·kg-1劑量組與洛哌丁胺組初次腹瀉時(shí)間明顯延遲(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組對(duì)硫酸鎂誘導(dǎo)的腹瀉也有抑制作用，但稀便數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)硫酸鎂誘導(dǎo)的腹瀉無明顯抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)硫酸鎂致小鼠腹瀉的影響

3.2.3對(duì)番瀉葉致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，洛哌丁胺組與蘇龍嘎-4顆粒0.33、0.65、1.30 g·kg-1劑量組初次腹瀉時(shí)間明顯延遲(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與模型組相比，洛哌丁胺組及蘇龍嘎-4顆粒0.33、0.65、1.30 g·kg-1劑量組稀便數(shù)均顯著降低(P<0.01)，表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)番瀉葉誘導(dǎo)的腹瀉有抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表5。

表 5 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)番瀉葉致小鼠腹瀉的影響

3.3 抗炎鎮(zhèn)痛作用

3.3.1對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 與空白組相比，模型組小鼠耳腫脹率顯著提高(P<0.001)，證明模型成立。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.65、1.30 g·kg-1劑量組和阿司匹林組均能顯著抑制二甲苯所致的耳腫脹(P<0.01，P<0.001)，抗炎作用顯著；蘇龍嘎-4顆粒0.16、0.33 g·kg-1劑量組對(duì)二甲苯所致耳廓腫脹也有抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇龍嘎-4顆粒對(duì)小鼠耳腫脹炎癥模型有消腫抗炎作用。各組小鼠的腫脹率和腫脹抑制率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表6。

表6 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)二甲苯所致小鼠 耳廓腫脹的影響

3.3.2對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響 與空白組相比，模型組小鼠扭體次數(shù)顯著提高(P<0.001)，證明模型成立。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒各劑量組和腸炎寧片組均能極顯著抑制醋酸引起的小鼠疼痛反應(yīng)，減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；均不能延遲初次疼痛時(shí)間(P>0.05)；各組小鼠的扭體次數(shù)和扭體抑制率的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7。

表7 蘇龍嘎-4顆粒對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響

4 討論

蘇龍嘎-4湯是止瀉作用顯著的蒙醫(yī)湯劑，其方中連翹、拳參、木通、麥冬均有抗炎、抗菌作用，連翹解熱止吐，拳參止瀉，木通利尿鎮(zhèn)痛效果顯著[5，19-20]。臨床上常用蘇龍嘎-4湯治療嬰幼兒腹瀉病，并且在長(zhǎng)期臨床使用中已證明療效確切[21-22]。已有實(shí)驗(yàn)研究表明蘇龍嘎-4湯劑和顆粒劑對(duì)小鼠小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)均有抑制作用[23]；蘇龍嘎-4湯劑能抑制腸道致病菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，能促進(jìn)杯狀細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，增強(qiáng)其分泌黏液功能，提高腸黏膜保護(hù)屏障作用[24-25]。但其藥效作用研究不夠全面，因此本實(shí)驗(yàn)從藥效角度出發(fā)，研究蘇龍嘎-4顆粒的澀腸、止瀉、抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

在小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中，炭末在小腸的推進(jìn)率間接反映了小腸的運(yùn)動(dòng)，其結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒對(duì)正常小鼠的腸推進(jìn)和蓖麻油腹瀉模型小鼠的腸推進(jìn)均有明顯的抑制作用，其作用與洛哌丁胺較接近，說明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)小腸蠕動(dòng)和蓖麻油刺激所致的小腸蠕動(dòng)紊亂均有抑制作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與參考文獻(xiàn)[23]研究結(jié)果一致，說明蘇龍嘎-4顆粒能夠抑制腸蠕動(dòng)。

在止瀉實(shí)驗(yàn)中，通過建立蓖麻油致滲出性腹瀉模型、硫酸鎂致滲透性腹瀉模型和番瀉葉致分泌性腹瀉模型3種常用的動(dòng)物藥物性腹瀉模型，來探討蘇龍嘎-4顆粒的抗腹瀉作用[26]。結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒對(duì)蓖麻油所致腹瀉的止瀉效果顯著且能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生，且其止瀉作用強(qiáng)于洛哌丁胺；蘇龍嘎-4顆粒對(duì)番瀉葉所致腹瀉的止瀉效明顯同樣能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生，但其對(duì)腹瀉的抑制作用低于洛哌丁胺；蘇龍嘎-4顆粒對(duì)硫酸鎂所致腹瀉的止瀉效果最不明顯，但能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生。表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)蓖麻油所致腹瀉的止瀉效果最強(qiáng)，對(duì)番瀉葉所致腹瀉的止瀉效果次之，對(duì)硫酸鎂所致腹瀉的止瀉效果最不明顯。3種腹瀉模型致瀉原理和部位均不同，蓖麻油與番瀉葉均為刺激性瀉藥。蓖麻油系刺激小腸性瀉藥，在胃腸道內(nèi)釋放蓖麻油酸，刺激腸黏膜損害黏膜細(xì)胞，引起炎癥而導(dǎo)致滲出性腹瀉，且蓖麻油及其有效成分會(huì)抑制腸道對(duì)水和電解質(zhì)的吸收，從而起到潤(rùn)腸通便的作用[27]。番瀉葉系刺激大腸性瀉藥，其致瀉機(jī)制主要是番瀉葉中的番瀉苷A、番瀉苷B經(jīng)胃和小腸吸收后，在肝中分解，分解產(chǎn)物進(jìn)入血液，經(jīng)血液循環(huán)引起骨盆神經(jīng)節(jié)興奮，從而收縮大腸、刺激結(jié)腸，增強(qiáng)腸蠕動(dòng)而促進(jìn)糞便排出[28-29]。硫酸鎂為容積性瀉藥，其使腸容積增大刺激腸壁而導(dǎo)致滲透性腹瀉。硫酸鎂在腸管內(nèi)吸收水分后膨脹，通過增加大便量，擴(kuò)張腸道容積，刺激腸蠕動(dòng)，從而增強(qiáng)導(dǎo)瀉效果[30-31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇龍嘎-4顆粒對(duì)小腸和大腸不同部位引起的腹瀉均能發(fā)揮作用，且對(duì)刺激性瀉藥蓖麻油和番瀉葉所致腹瀉的止瀉效果強(qiáng)于容積性瀉藥硫酸鎂。

在抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，分別采用二甲苯所致小鼠耳廓腫脹法研究蘇龍嘎-4顆粒的消炎作用，小鼠醋酸扭體法研究蘇龍嘎-4顆粒的鎮(zhèn)痛作用。在二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，二甲苯涂在小鼠耳廓上面，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增大，組織液滲透增多，產(chǎn)生紅腫現(xiàn)象[15]。通過測(cè)量小鼠耳朵質(zhì)量計(jì)算腫脹率和腫脹抑制率，反映蘇龍嘎-4顆粒對(duì)急性炎癥抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒能顯著降低腫脹率、提高腫脹抑制率，其作用強(qiáng)于阿司匹林，表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)小鼠二甲苯所致的耳腫脹具有明顯的消炎作用。在醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，蘇龍嘎-4顆粒4個(gè)劑量組均能明顯減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)、提高扭體抑制率，其作用強(qiáng)于腸炎寧片，表明蘇龍嘎-4顆粒對(duì)小鼠腹腔注射醋酸引起急性腹膜炎而產(chǎn)生的疼痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果。

綜上所述，本研究證明了蘇龍嘎-4顆粒具有澀腸、止瀉、抗炎及鎮(zhèn)痛作用，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。其結(jié)果為蘇龍嘎-4顆粒的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)參考，作用機(jī)制方面還有待進(jìn)一步研究。