甘草酸的抗病毒作用

楊秀偉

北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191

入侵人類的病毒基本上可分為兩類，一類是以人類為長期宿主的病毒群，如人類常見的流行性病毒性疾?。核?、風疹、皰疹、麻疹、天花、脊髓灰質炎、乙腦、腮腺炎、巨細胞病毒，甲型和乙型肝炎病毒，登革熱病毒以及人流感病毒等，亦包括人類免疫缺陷病毒(HIV)和人類乳頭瘤病毒(HPV)，亦稱人類長駐病毒群，這些病毒參與人類微生態(tài)學組成；重癥急性呼吸綜合征(SARS)、埃博拉(Ebola)、中東呼吸綜合征(MERS)等冠狀病毒科(coronavirus)病毒和寨卡(Zika)黃病毒科、黃病毒屬病毒等也歸于人類的長駐病毒群。因為入侵途徑和感染細胞的差異、宿主免疫反應強度以及免疫病理分布不同而導致臨床各類疾病表現(xiàn)不同。另一類是以臨近人類的物種(雞、狗、豬、馬、羊等)為長期宿主但能跨物種感染人類的病毒群，如禽流感、狂犬病、漢坦等病毒。實際上，冠狀病毒是致人類呼吸道感染的常見病毒之一，在全世界普遍存在，造成的臨床表現(xiàn)各不相同[1]?？茖W家將已知的冠狀病毒分為4組：1)犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、人冠狀病毒等；2)牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒等；3)鳥傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒和大鼠冠狀病毒；4)SARS病毒。SARS之后，在人類中又相繼發(fā)現(xiàn)HCoV-NL63和HCoV-HKU1 2種病毒。2020年1月7日，實驗室檢出造成我國湖北武漢肺炎疫情的病毒，其為1種新型冠狀病毒[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)于2020年1月12日將這種新型冠狀病毒正式命名為“2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)”[3]，日內瓦時間2020年2月11日WHO發(fā)布了新冠病毒肺炎的疾病名稱COVID-19(Corona Virus Disease 2019)；其后，國際病毒分類委員會將其命名為“SARS-CoV-2”(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)。2019-nCoV究竟是發(fā)源于中國？還是其他國家？目前是一個未明的問題。延著2003年和2012年分別暴發(fā)的SARS、MERS冠狀病毒的研究歷史，人們在追溯2019-nCoV的來源，蝙蝠→果子貍或穿山甲→人的傳播鏈等被提出，但證據(jù)都不足；病毒是絕對的寄生物種，離開宿主細胞就沒有生命了。人體估計至少存有38萬億個細菌[4]與380萬億多個病毒[5]，在人體腸道發(fā)現(xiàn)1200多種病毒基因組[6]，但這個龐大的人體病毒組(human virome)并不完全屬于人體，大部分是以人體肺與呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等部位的細菌為宿主而存在的，其可能影響細菌微生態(tài)平衡，間接影響人體。因此，是否也存在人類長駐病毒群變異所致2019-nCoV也是一個需要考慮的問題。最近，美國得克薩斯大學奧斯汀分校McLellan團隊在BioRxiv上發(fā)表論文，報道了2019-nCoV突刺蛋白的首個冷凍電鏡結構[7]，提供了大量信息，為相關醫(yī)療對策的開發(fā)奠定了基礎，如推動新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)。目前，對確診COVID-19患者給予α-干擾素霧化吸入治療、洛匹那韋(Lopinavir)/利托那韋(Ritonavir)(抗HIV病毒藥物)等抗菌抗病毒治療，但洛匹那韋/利托那韋可引起腹瀉、惡心、嘔吐、肝功能損害等不良反應[8-10]。雖然非典期間用糖皮質激素治療SARS挽救了許多患者的生命，但也帶來了多方面的不良反應，如SARS 恢復期的骨壞死、二重感染、結核播散、電解質紊亂以及糖尿病等。盡管隨著現(xiàn)代科學的進步，人們對不可預料的新生事物的認知不斷加快和加深，但祖國中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的歷史實踐，積累了許多抗病毒藥物的經(jīng)驗，如甘草就是值得一提的中藥之一，尤其是甘草的主要成分之一的甘草酸具有糖皮質激素樣作用。本研究對其抗病毒活性的研究進展進行綜述，希望能為新冠肺炎疫情的防控提供參考。

1 甘草的資源

甘草為豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionatae Taub.)的多年生草本植物，全球均有分布，約18種[11]，分布遍及全球各大洲，以歐亞大陸為多，但以亞洲中部的分布最為集中。我國處于甘草資源中心地帶。我國生藥學家樓之岑院士早在1954年發(fā)表了《國產(chǎn)甘草成分含量測定的研究》的論文，證明國產(chǎn)甘草完全符合蘇、英、日、美各國藥典規(guī)定的甘草品質標準[12]，為我國甘草首次進入國際市場提供了科學依據(jù)。迄今，我國已是世界上甘草使用量及出口量最大的國家。除了藥用價值外，甘草及其提取物在食品、飲料、化妝品等工業(yè)中也有廣泛的應用。甘草屬(GlycyrrhizaL.)植物藥用歷史悠久，國外早在古埃及、古希臘時期就用甘草治療咳嗽、胃病及肝臟疾病[13]。在我國歷史上，成書于漢代的《神農本草經(jīng)》將甘草列為上品。甘草素有“國老”“十方九草”之譽，具有益氣補中、祛痰止咳、緩急止痛、緩和藥性和清熱解毒的功能，臨床應用廣泛。

我國有甘草7種[11]，分別為粗毛甘草G.asperaPall.、光果甘草G.glabraL.、脹果甘草G.inflataBatalin、刺果甘草G.pallidifloraMaxim.、圓果甘草G.squamulosaFranch.、甘草G.uralensisFisch.ex DC.和云南甘草G.yunnanensisS.H.Cheng et L.K.Dai ex P.C.Li，其中的光果甘草、脹果甘草和甘草已收載在《中華人民共和國藥典》中[14]。這些種在其他國家也有分布(見表1)。

表1 7種甘草的主要分布地

2 抗病毒作用

2.1 甘草在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中出現(xiàn)的頻數(shù)

2019年12月以來，湖北省武漢市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例新型冠狀病毒感染的肺炎患者，隨著對疾病認識的深入和診療經(jīng)驗的積累，國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局形成了《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[15]，包括推薦使用的中藥復方，其中，甘草出現(xiàn)的頻數(shù)為4，為最高之一。

2.2 實驗研究

2.2.1抗流感病毒和冠狀病毒

2.2.1.1提取物水平 灌胃小鼠甘草粗提取物能明顯抑制H9N2亞型流感病毒感染小鼠的肺炎病變，明顯延長感染小鼠的生存時間[16]。甘草提取物有抑制流感病毒單股負鏈RNA包膜病毒蛋白的作用，最大半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.27 mg·mL-1，選擇性地抑制單股負鏈RNA包膜病毒蛋白的合成[17]。

2.2.1.2單體化合物水平 甘草屬植物化學成分具有化學結構多樣性，迄今為止從不同種甘草中分離鑒定的各類化合物超過400余個[11，18]，主要成分為五環(huán)三萜和黃酮等類化合物[19]，不同化學結構類型化合物在腸內吸收可能各異[20]，且在腸內具有代謝不穩(wěn)定性[21]。

如甘草中典型的三萜類化合物甘草酸(glycyrrhizic acid；glycyrrhizin，1)在人腸內細菌的作用下首先轉化為甘草次酸-3-O-單-β-D-葡萄糖醛酸苷(glycyrrhetic acid-3-O-mono-β-D-glucuronide，2)，后者繼續(xù)脫去葡萄糖醛酸基，轉化為甘草次酸(glycyrrhetic acid，3)，轉化過程見圖1。與原形甘草酸相比，甘草次酸在腸內細菌作用下由甘草酸釋放出，是分子狀態(tài)，更易被吸收進入體循環(huán)。如果是甘草次酸直接給藥，可能其在腸內會有顆粒析出，導致生物利用度降低。甘草酸可在人工條件下轉化為甘草酸單銨鹽(monoammonium glycyrrhizinate)、甘草酸二銨鹽(diammonium glycyrrhizinate)、甘草酸單鉀鹽(monopotassium glycyrrhizinate)、甘草酸二鈉鹽(disodium glycyrrhizinate)等。

研究表明，灌胃小鼠甘草酸單銨鹽能明顯抑制H9N2亞型流感病毒鼠肺炎病變[16]。給感染致死劑量A2型流感病毒(H2N2)的小鼠腹腔注射甘草酸，小鼠的平均存活時間明顯延長，肺組織的實變程度和病毒滴度明顯低于對照組。深入研究發(fā)現(xiàn)，如果在小鼠同時給予抗γ-干擾素的單克隆抗體，則檢測不到甘草酸抗流感病毒的活性，提示甘草酸抗流感病毒是通過刺激T細胞產(chǎn)生γ-干擾素實現(xiàn)的[22]。亦有研究表明，高遷移率組框蛋白1(High-mobility-group box protein 1，HMGB 1)在細胞核內流感病毒復制中起著非常重要的作用，HMGB 1與流感病毒核蛋白結合能促進病毒生長并增強病毒聚合酶的活性，甘草酸通過抑制其結合，能降低流感病毒聚合酶的活性而抑制流感病毒復制[23]。

甘草酸在培養(yǎng)的氣道上皮細胞有糖皮質激素樣的抗炎作用，在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或白介素-4(interleukin-4，IL-4)誘導的小鼠肺炎模型體內實驗中，甘草酸能明顯減少杯狀細胞(goblet cell)增生和MUC(mucin)5AC mRNA 的表達[24]，提示甘草酸對呼吸道炎癥有治療作用。在LPS所致急性肺損傷模型中，甘草酸能緩解組織病理變化、中性粒細胞浸潤，抑制環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達[25]；甘草酸單銨鹽能提高肺泡灌洗液中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，同時避免環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶(cAMP-PDE)活性的增強，在肺組織中上調IL-10的水平，下調腫瘤壞死因子-α[26]；在角叉菜膠所致急性肺損傷模型，腹腔給予甘草酸能顯著降低核因子κB 和信號轉導與激活轉錄-3(signal transducer and activator transcription-3，STAT-3)[27]。

圖1 甘草酸在人腸內菌作用下的轉化

對于冠狀病毒，甘草酸對SARS-CoV(SARS-coronavirus)也有抑制作用[28-29]。在其后對15個甘草酸衍生物和甘草次酸(化學結構見圖2)進行抗SARS-CoV活性研究中，發(fā)現(xiàn)甘草酸的某些衍生物抗SARS-CoV活性更強，結果見表2[30]。如果在甘草酸的C-3糖苷鏈上引入2-乙酰胺基-β-D-吡喃葡萄糖胺(2-acetamido-β-D-glucopyranosylamine，1)基，則抑制活性增加了近9倍，且其細胞毒性降低；化合物2的半數(shù)最大效應濃度(EC50)是35 μmol·L-1，在匯合Vero細胞培養(yǎng)上，使50%細胞死亡時的藥物質量濃度(CC50)是1462 μmol·L-1，抑制作用是原形化合物甘草酸的10倍，選擇指數(shù)(CC50/EC50的比值，SI)是41；對于結合2個氨基酸殘基和1個游離的C30-COOH衍生物來說，抑制活性比甘草酸強70倍，但其細胞毒性升高，因而降低了治療的安全性。這些研究結果有助于篩選到藥效優(yōu)秀、治療安全指數(shù)高的抗SARS-CoV的甘草酸衍生物藥物。文獻中亦有報道認為：甘草酸衍生物的藥理活性比原形甘草酸強，不良反應較少[31]。

圖2 15個甘草酸衍生物和甘草次酸的化學結構

表2 甘草酸、甘草次酸及甘草酸衍生物在Vero細胞 對SARS-CoV復制的影響

注：—表示無法計算。

從圖1可知，甘草次酸是甘草酸在體內的代謝產(chǎn)物或腸內菌生物轉化產(chǎn)物。甘草次酸不但能誘導一氧化氮產(chǎn)生，而且還可通過激活巨噬細胞中調控一氧化氮合酶(iNOS)轉錄的核因子κB轉錄因子復合物上調iNOS基因在小鼠腹腔巨噬細胞中的表達[32]。甘草次酸可促使核因子κB的蛋白質/DNA結合位點結合到其同源位點上，進而激活核因子κB，從而調控iNOS的轉錄。一氧化氮作為1個宿主防御分子，在天然免疫中發(fā)揮作用，具有抗病毒活性。

由于肺炎重癥死亡大都是“炎癥風暴”無法控制，所以，理論上推測甘草酸對肺炎應該具有治療作用。鑒于2019-nCoV具有血管緊張素轉化酶2(ACE2)受體，因此，ACE2上的靶點作為抗2019-nCoV藥物研發(fā)篩選模型已被應用。最近，采用分子對接的方法，對中藥中能夠與ACE2結合的化合物進行了篩選，結果表明，甘草中的甘草酸能夠與ACE2結合，提示甘草酸是潛在的抗COVID-19的化合物[33]。此外，研究發(fā)現(xiàn)ACE2在心臟、食管、腎臟、膀胱和回腸均有表達，且表達量高于肺。因此，甘草酸對于2019-nCoV累及的這些器官損傷可能具有潛在的作用。

2.2.2抗單純皰疹病毒 目前發(fā)現(xiàn)的皰疹病毒超過100種，與人類感染相關的至少有8種，包括單純皰疹病毒1(herpes simplex virus 1，HSV-1)、HSV-2、非洲淋巴細胞瘤病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細胞病毒等。皰疹病毒廣泛存在于自然界。

一項對光果甘草根水提取物治療感染HSV-1有效性的研究結果表明，其具有抗HSV-1病毒的特性，其機制可能是其具有很強的抗粘附性，可直接抑制HSV-1病毒感染的細胞間粘附[34-35]，它的主要成分之一的甘草酸不但能抑制病毒生長而且可使病毒顆粒失活[36]。甘草次酸衍生物甘珀酸鈉(carbenoxolone，CBX)和環(huán)胃酮鈉(cicloxolone，CCX)具有抗HSV-1和HSV-2的作用[37]，化學結構見圖3。其可顯著抑制HSV-1和HSV-2的復制，使感染性病毒顆粒的數(shù)量減少10 000～100 000倍。CBX和CCX在高劑量下，可使HSV-1和HSV-2對幼倉鼠腎細胞的吸附減少20%～40%；兩者比較后發(fā)現(xiàn)，CCX抑制HSV復制的作用比CBX更強；兩者抑制HSV-2復制的作用更強。

圖3 CBX和CCX的化學結構

甘草酸對EBV的復制具有抑制活性，并呈劑量依賴效應，對病毒的IC50為0.04 mmol·L-1；對宿主細胞毒的IC50為4.8 mmol·L-1；治療指數(shù)為120。甘草酸主要在EBV復制循環(huán)的早期發(fā)揮作用，對病毒吸附?jīng)]有影響，也不會使EBV顆粒失活[38]。提示甘草酸抗EBV可能是在病毒復制早期通過抑制病毒侵入宿主細胞來實現(xiàn)的。甘草酸還對卡波濟氏肉瘤皰疹病毒-8(Kaposi′s sarcoma herpesvirus-8)具有抑制活性，抑制其裂解性復制，且能有效清除處于潛伏感染期的皰疹病毒[39]，其潛在的機制主要是多順反子潛在的復制表達異常，包括不能產(chǎn)生編碼潛伏相關核抗原(latency associated nuclear antigen，LANA)病毒mRNA 的成熟形式[40]。甘草酸亦能抑制慢性乙肝病人的卡波濟氏肉瘤病毒的復制[41]。

2.2.3抗艾滋病病毒 自1981年美國報告首例艾滋病以來，目前艾滋病已蔓延至全球150多個國家。有效控制、根治艾滋病已成為全球亟待解決的問題。艾滋病是1種危害性大的傳染病，由感染艾滋病病毒(human immuno-deficiency virus，HIV)引起。HIV把人體免疫系統(tǒng)中最重要的CD4T淋巴細胞作為主要攻擊目標，使人體喪失免疫功能。HIV在人體內的潛伏期平均為8～9年，患艾滋病以前，可以沒有任何癥狀地生活和工作多年。早在20世紀80年代末，日本學者首次報道了甘草酸抗HIV的作用。實驗結果表明，甘草酸能有效抑制HIV的復制[42-44]，且具有免疫激活作用。甘草酸對HIV增殖的IC50值約為1.23 μg·mL-1，抑制HIV感染的有效濃度高，范圍狹窄，如果維持其在血液中的有效濃度，須持續(xù)大量給藥[42]。甘草酸抗HIV的機制可能是通過降低蛋白激酶C的活性從而間接抑制HIV的復制；同時還具有抑制HIV吸附宿主細胞的作用[43]。實驗在HIV感染者的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells)中檢測到甘草酸的抗HIV作用，甘草酸可誘導趨化因子配體(chemokine ligand)4(CCL4)和CCL5的產(chǎn)生。研究結果表明：甘草酸具有通過誘導β-趨化因子產(chǎn)生從而抑制HIV復制的潛力[45]。研究亦發(fā)現(xiàn)，甘草酸還可以通過降低細胞膜的流動性以減少細胞間的融合而抑制HIV在細胞間的繁殖和擴散[46]。在單核細胞源性的巨噬細胞中也證實了甘草酸能通過抑制CCL2或白介素-10的產(chǎn)生從而抑制多形核中性粒細胞依賴性的R5 HIV(利用CC趨化因子受體5輔助受體進入細胞的HIV-1稱為R5 HIV)病毒的復制[47]。

2.2.4抗肝炎病毒 作為流行廣泛且危害嚴重的傳染性疾病，慢性乙型肝炎和丙型肝炎已成為一個社會性的健康問題。乙型肝炎由感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起，丙型肝炎由感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起。目前全球約有3.5億～4億HBV慢性感染者；1.7億HCV感染者，感染率約為3%。

甘草酸具有直接抗HBV的活性，且對宿主細胞沒有毒性[48]。有研究表明，甘草酸能抑制HBV感染細胞乙肝表面抗原(HBsAg)向細胞外分泌，可能抑制肝細胞的破壞，改善慢性乙肝患者肝功能障礙，從而改善了對HBV的免疫狀況。由此推論甘草酸有直接的抗HBV作用及對肝功能障礙的改善作用[49]。甘草酸抗HBV的作用機制復雜，實際上目前尚未完全清楚。臨床上，甘草酸在降低谷氨酰轉肽酶、乙肝病毒等指標上有明顯的療效[50]。甘草酸二銨鹽在臨床上的應用也取得了良好的療效，活性更佳，具有較強的抗炎、保護肝細胞膜和改善肝功能的作用[51-52]。

甘草酸亦有較強的抗HCV作用。在感染HCV的肝細胞使用無毒劑量的甘草酸，HCV核心基因(core gene)在mRNA和蛋白質水平的表達水平下降，呈劑量依賴性，且與干擾素有協(xié)同作用[53]。含有甘草酸的制劑SNMC(stronger neo-minophagen C)可保護線粒體免受HCV蛋白誘導的氧化應激損傷，有效降低丙型肝炎患者罹患肝硬化的幾率[54]。甘草酸和它的單銨鹽是良好的抗HCV藥物的先導化合物[55]。

3 新型冠狀肺炎患者“肺泡黏液病理性充盈”適合甘草酸的糖皮質激素樣作用治療

由于甘草酸的苷元甘草次酸的化學結構與甾體激素酷似，因此可作為配體與甾體激素受體及其代謝酶結合，演變出豐富多彩和復雜多樣的生物學效應。糖皮質激素樣作用是甘草酸及其苷元甘草次酸的重要的藥理作用之一[56-58]。COVID-19患者的病理解剖學研究表明[59]，流式細胞術可發(fā)現(xiàn)淋巴細胞減少，淋巴細胞同時也被過度激活。此外高度促炎性的CCR4+CCR6+Th17細胞增加，此部分解釋了肺部嚴重的免疫損傷；同時，伴有“肺泡黏液(痰液)病理性充盈”。這適合臨床上將甘草酸作為弱糖皮質激素樣藥物應用，不僅能增強糖皮質激素的作用，而且拮抗大劑量糖皮質激素的不良反應[60]。

4 臨床常用的甘草酸現(xiàn)代中藥制劑

來源于中藥，通過現(xiàn)代科技手段和技術研制的藥物，稱為現(xiàn)代中藥。甘草為傳統(tǒng)中藥，由于其廣泛的生物學活性和作用，甘草酸制劑在20世紀40年代即應用于肝病的治療，70年代開始有明確的科學性研究論述[61]。目前市場上已有甘草酸單銨、甘草酸二銨、復方甘草酸苷、甘草酸二銨脂質體和異甘草酸鎂等多種形式的產(chǎn)品，研制成許多現(xiàn)代中藥制劑在臨床上應用(見表3)，積累了許多臨床經(jīng)驗。隨著研究的深入，循證醫(yī)學證據(jù)將不斷指導甘草酸制劑新的臨床應用。

表3 中國臨床常用的甘草酸制劑

5 結語

雖然目前多種冠狀病毒的分離、結構解析已經(jīng)完成[62-65]，對2019-nCoV亦有了一些了解[7，62-63，66-67]，但至今仍沒有針對性的特效藥物[68]。中醫(yī)沒有病毒性肺炎的病名，此病屬于中醫(yī)疫病的范疇，病因為感受疫戾之氣，病位在肺，基本病機特點為“風、熱、濕、毒、瘀”。西漢以來的兩千多年里，中國先后發(fā)生過321次疫病流行[69]，中醫(yī)藥辯證治療疫病有著豐富的臨床經(jīng)驗，在有限的地域和時間內控制住了疫情的蔓延。中醫(yī)藥在中華民族歷次疫病中不斷發(fā)展完善，在守正中不斷創(chuàng)新突破，潛力巨大。隨著生物的進化或變異，亦可能產(chǎn)生新的“疫病”，應該嚴陣以待，打有準備之仗。