基于網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接技術(shù)預(yù)測熱炎寧合劑抗COVID-19作用△

王梅，唐志書，劉妍如，宋忠興，周瑞，許洪波，于金高，趙夢利，周建平

1.陜西中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)/ 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；3.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在世界范圍內(nèi)的大規(guī)模傳播是2020年初流行病學的重大事件，其危害及規(guī)模已超過H1N1流感。雖然目前我國對COVID-19采取了有效的控制措施，使其確診率大大降低；然而，2020年3月9日，世衛(wèi)組織發(fā)布的最新COVID-19情況報告稱，當前COVID-19在全球100多個國家地區(qū)蔓延，病例數(shù)超10萬，COVID-19成為大流行(病)的威脅已變得非?，F(xiàn)實。有研究表明病毒已經(jīng)出現(xiàn)變異，每個國家病毒的傳染性和毒性有了不同改變，而針對新型冠狀病毒[世界衛(wèi)生組織(WHO)將其命名為2019 novel coronavirus(2019-nCoV)，國際病毒分類委員會將其命名為severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)]的疫苗尚未研制成功，有效干預(yù)COVID-19的上市藥物也很少，其臨床有效性和安全性仍待觀察。在無明確病因、無特效藥、無疫苗的情況下，我國中醫(yī)發(fā)揮所長，針對COVID-19“濕、熱、毒、瘀”的核心病機，側(cè)重增強機體的抵抗能力和修復(fù)能力，不斷開發(fā)出“對癥”的復(fù)方方劑，為疫情控制提供了有效的防治策略。

熱炎寧合劑是《陜西省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》中對于治療COVID-19臨床輕、重癥的推薦指定用藥。該制劑由半枝蓮、虎杖、北敗醬和蒲公英組成，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效[1]。為了系統(tǒng)評價熱炎寧合劑對COVID-19的干預(yù)作用，篩選其中具有抗2019-nCoV活性的成分。本研究基于中醫(yī)藥整體性、系統(tǒng)性的研究策略，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從整體預(yù)測藥物靶點、作用通路和干預(yù)機制，以分子對接技術(shù)對抗病毒活性成分進行虛擬篩選，以闡釋其治療作用內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 熱炎寧合劑干預(yù)COVID-19的可行性

1.1.1化學成分收集與篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http：//www.tcmspw.com)、中國天然產(chǎn)物化學數(shù)據(jù)庫(http：//www. pharmdata.ac.cn/cnpconline/)中，以熱炎寧中組方中藥蒲公英、虎杖、北敗醬和半枝蓮為搜索詞，收集各組方中藥的主要化學成分[2]。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%或類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為進一步篩選條件。

1.1.2“成分-疾病”靶點篩選 從TCMSP、Drugbank(https：//www.drugbank.ca/)、Pubchem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中搜索化合物對應(yīng)的靶點，以UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/uniprot/)對收集的靶點進行規(guī)范化和校正，建立成分相關(guān)的基因靶點列表。以“SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)”“Respiratory Failure”為關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、MalaCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.malacards.org/)和TTD數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Targets Database，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)中搜索已報道的與冠狀病毒感染相關(guān)的基因。剔除重復(fù)和假陽性基因后，建立冠狀病毒感染相關(guān)的靶點基因列表。

1.1.3“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對上述得到的成分相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點取靶點交集。將交集內(nèi)靶點以STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，查詢蛋白相互作用信息，構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)設(shè)置：種屬為人類(Homosapiens)。

對PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白互作信息、“成分-疾病-靶點”及“中藥-成分”信息進行整合，將整理后數(shù)據(jù)分別Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。成分與中藥、疾病和靶點之間的關(guān)系用網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊來描述，通過Cytoscape的Network analysis插件來分析并提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點和邊的特征。

1.1.4生物過程注釋及代謝通路分析 為了闡述熱炎寧合劑與疾病相關(guān)成分的靶點在生物過程中的功能的作用機制，以R軟件包(3.6.2)的Cluster profiler包對“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點進行GO(Gene Ontology)生物信息學富集，以3個本體(Ontology)描述基因靶點的分子功能(Molecular Function，MF)、所處的細胞位置(Cellular Component，CC)和參與的生物過程(Biological Process，BP)[3]；以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫富集靶點基因參與的主要生化代謝途徑，并對其關(guān)聯(lián)關(guān)系進行注釋，以P<0.05為顯著性差異判定卡值。采用ggplot2包對GO和KEGG通路富集結(jié)果進行可視化處理。

1.2 熱炎寧合劑抗2019-nCoV的活性化合物預(yù)測

1.2.1靶點與配體預(yù)處理 以上海科技大學饒子和/楊海濤課題組公布的COVID-19 3CLpro高分辨率晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：6LU7)為對接模板，采用Schrodinger-2018軟件的Protein preparation wizard模塊對6LU7結(jié)構(gòu)進行加氫、去水、去雜原子等預(yù)處理。以6LU7原配體化合物為參照，以1.1中篩選的活性成分為對接配體，采用Ligprep模塊對各成分結(jié)構(gòu)(*.sdf)進行加氫等優(yōu)化預(yù)處理后生成批量處理文件。

1.2.2分子對接 以原始配體分子為中心，采用Receptor Grid Generation 模塊生成格點文件(盒子大小設(shè)為14?)。以6LU7作為剛性受體，熱炎寧合劑活性成分結(jié)構(gòu)作為構(gòu)象可變化(柔性)配體，進行半柔性對接。由于Docking Score值<-7.0時說明受體-配體間有很高的結(jié)合活性，因此對接結(jié)果以對接打分值docking core≤-7.0作為篩選條件[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱炎寧合劑干預(yù)COVID-19的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1活性成分篩選 結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫和中國天然產(chǎn)物化學數(shù)據(jù)庫收載的熱炎寧合劑組方中藥成分，一共得到156個成分。OB≥30%或DL≥0.18作為進一步篩選條件，得到符合篩選標準的活性成分49個。

2.1.2“成分-疾病-靶點”篩選 從TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫中搜索得到熱炎寧合劑的49個活性成分對應(yīng)的靶點共有239個，以Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索校正后生成“成分-靶點”集合。從MalaCards數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中得到關(guān)于冠狀病毒感染誘發(fā)的“SARS”和“Respiratory Failure”相關(guān)的靶點共計144個，生成“疾病-靶點”集合。將上述得到的“成分-靶點”和“疾病-靶點”集合取靶點交集，并繪制交集維恩圖，得到交集靶點35個(見圖1A)。將交集內(nèi)靶點以STRING 11.0構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)(見圖1B)，PPI網(wǎng)絡(luò)中共有35個節(jié)點，264條邊，平均節(jié)點數(shù)為15.1，平均邊數(shù)57條。以k-means法對靶點進行聚類，得到3個分類，以從紅色到藍色表示基因計數(shù)(gene count)由大到小。

2.1.3“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將2.1.2篩選得到的35個靶點與中藥進行映射關(guān)聯(lián)，得到29個化學成分的“成分-靶點”關(guān)聯(lián)表，與PPI互作表一同導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建熱炎寧合劑的“中藥-化合物-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。如圖1C所示(紅色：活性化合物；綠色：靶點；藍色：組方中藥)，所構(gòu)建的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)包括68個節(jié)點(4種中藥，29個成分，35個靶點)和480條邊。網(wǎng)絡(luò)圖中以節(jié)點大小表示度數(shù)大小，度數(shù)的大小代表該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性；接近中心度大小表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的中心度。該網(wǎng)絡(luò)中成分度值較大，接近中心度>0.45的化合物為槲皮素(度數(shù)=42)、木樨草素(度數(shù)=45)、蒲公英萜酮(度數(shù)=24)、β-谷甾醇(度數(shù)=12)和芹菜素(度數(shù)=12)。網(wǎng)絡(luò)中度數(shù)較大，接近中心度>0.45的靶點為環(huán)氧化酶1(PTGS1)(度數(shù)=38)、腫瘤壞死因子(TNF)(度數(shù)=33)、白細胞介素6(IL6)(度數(shù)=33)、白細胞介素10(IL10)(度數(shù)=32)、白細胞介素1β(IL1B)(度數(shù)=30)和C-C趨化因子配體2(CCL2)(度數(shù)=28)等15個靶點。相比其他3個中藥，該網(wǎng)絡(luò)中半枝蓮度數(shù)(度數(shù)=49)和接近中心度數(shù)值(0.47)較大，說明半枝蓮是熱炎寧合劑在干預(yù)COVID-19中較為重要的組方中藥，其主要成分木樨草素、芹菜素和β-谷甾醇可通過作用于PTGS1(度數(shù)=38)、IL6(度數(shù)=33)和IL10(度數(shù)=32)發(fā)揮作用。其次，虎杖在網(wǎng)絡(luò)中度值(度數(shù)=40)和接近中心度(0.40)也較高，其主要成分槲皮素、木樨草素和β-谷甾醇可作用于PTGS1、IL6、IL10、IL1B和CCL2發(fā)揮作用。以上結(jié)果表明熱炎寧合劑在干預(yù)COVID-19的過程中具有多成分、多靶點的協(xié)同作用。

2.1.4熱炎寧合劑干預(yù)COVID-19的生物信息富集及代謝通路注釋 將“中藥-成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)中篩到的對應(yīng)的15個靶點通過Cluster profiler進行生物信息學GO富集分析和KEGG通路注釋，共富集到24條生物學過程，7條代謝通路。GO富集分析結(jié)果，見圖2，這些靶點主要分布于細胞外空間(GO：0005615，extracellular space)和質(zhì)膜外側(cè)(GO：0009897，external side of plasma membrane)。其MF主要與細胞因子活性(GO：0005125，cytokine activity)、細胞因子受體結(jié)合(GO：0005126，cytokine receptor binding)、分子功能調(diào)節(jié)劑(GO：0098772，molecular function regulator)、生長因子受體結(jié)合(GO：0070851，growth factor receptor binding)和趨化因子活性(GO：0008009，chemokine activity)有關(guān)。BP主要涉及信號轉(zhuǎn)導受體活性的調(diào)節(jié)(GO：0010469，regulation of signaling receptor activity)、對脂多糖的反應(yīng)(GO：0032496，response to lipopolysaccharide)、炎癥反應(yīng)(GO：0006954，inflammatory response)、防御反應(yīng)(GO：0006952，defense response)和免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)(GO：0002684，positive regulation of immune system process)。這些靶點主要參與的代謝通路為：細胞因子受體相互作用通路(hsa04060，Cytokine-cytokine receptor interaction)和IL-17信號通路(hsa04657，IL-17 signaling pathway)。

注：A.“成分-疾病”靶點交集韋恩圖；B.篩選靶點PPI圖；C.“中藥-成分-靶點”關(guān)聯(lián)圖(藍色為中藥；紅色為成分；綠色為靶點)。圖1 熱炎寧合劑“中藥-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖構(gòu)建

2.2 熱炎寧合劑中潛在2019-nCoV 3CL pro(PDB ID：6LU7)抑制劑篩選

2.2.1對接體系驗證 通過將對接前后的6LU7原始配體進行構(gòu)象疊合來驗證對接體系的準確度，結(jié)果顯示均方根偏差(RMSD)值為1.281 3? < 2?，說明該對接體系適用于配體成分與受體6LU7的半柔性對接。

2.2.2熱炎寧合劑化合物對接測試 將“中藥-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的29個化合物與對接體系(包括6LU7預(yù)處理受體和格點文件)進行對接測試，以對接打分值 ≤-7.0作為篩選條件，結(jié)果得到符合篩選標準的化合物7個，具體信息見表1，對接結(jié)果表明，大部分化合物主要和受體結(jié)合位點發(fā)生氫鍵作用，且這些化合物主要為黃酮類化合物，其結(jié)合主要為4位羰基氧和GLU166形成氫鍵，7位和4′位羥基分別和LEU141、CYS145、ASP187形成氫鍵(見圖3)。中藥歸屬顯示，這7個化合物主要歸屬為半枝蓮，說明該中藥可能是熱炎寧合劑中發(fā)揮抗病毒作用的主要中藥，說明熱炎寧合劑中干擾病毒復(fù)制的有效成分主要來自于半枝蓮的黃酮類化合物。

圖2 熱炎寧合劑靶點GO富集及KEGG通路注釋

3 討論

熱炎寧合劑由半枝蓮、虎杖、北敗醬和蒲公英組方而成。方中半枝蓮味辛、苦，歸肺、肝、胃經(jīng)，以清熱解毒見長，又具化瘀利尿之效。虎杖性微寒，味微苦。歸肝、膽、肺經(jīng)，具有祛風利濕、止咳化痰的功效，又可利濕破瘀。北敗醬微寒，味苦，歸大腸、肝經(jīng)，既可清熱解毒，又可活血化瘀；蒲公英性寒，味甘、苦，具有清熱解毒，利尿散結(jié)的作用。四藥協(xié)同為用，既可針對發(fā)熱、咳嗽發(fā)揮清熱解毒、止咳化痰的功效，又可針對并發(fā)癥發(fā)揮利濕破瘀、活血散結(jié)的功效。目前，陜西省傳染病醫(yī)院(西安市第八醫(yī)院)、西安交通大學第二附屬醫(yī)院、湖北省松滋市人民醫(yī)院等多家醫(yī)院已將熱炎寧合劑作為治療COVID-19的臨床一線制劑。

注：橙色球棍模型為候選化合物分子；藍色為氮原子；紅色為氧原子。圖3 6LU7與熱炎寧合劑活性化合物相互作用圖

表1 熱炎寧合劑活性化合物對接、篩選結(jié)果及關(guān)聯(lián)中藥分析

對接成分對接打分化學成分相對分子量中藥MOL000008-8.051芹菜素apigenin270.25半枝蓮、虎杖、北敗醬、蒲公英MOL012251-7.638白楊素甲醚chrysin-5-methylether268.28半枝蓮MOL012249-7.5287,2′-dihydroxy-5,8-dimethoxyflavone314.31半枝蓮MOL001040-7.455(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one272.27半枝蓮MOL012250-7.4417-hydroxy-5,8-dimethoxy-2-phenyl-chromone298.31半枝蓮MOL012247-7.3775,7-dihydroxy-8-methoxy-2-(2-methoxyphenyl)chromone314.31半枝蓮MOL000492-7.069兒茶素catechin290.29虎杖、北敗醬、蒲公英

盡管已有大量臨床研究、病理學、分子生物學研究證明了熱炎寧合劑對呼吸系統(tǒng)感染的有效性，其作用機制仍然未有闡明[5-8]。因此，本研究通過對熱炎寧合劑“中藥-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，熱炎寧合劑中的活性成分與冠狀病毒感染誘發(fā)的“急性呼吸綜合征”的15個靶點相關(guān)。其中，CCL2、CD40LG、CXCL10、CXCL8、IFNG、IL10、IL13、IL1B、IL2和IL6在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位。靶點生物信息學的富集結(jié)果顯示，熱炎寧合劑中的活性成分可能通過參與多種生物途徑發(fā)揮干預(yù)COVID-19的作用，主要涉及細胞因子受體相互作用通路和IL-17信號通路，這些生物過程與病毒感染造成的“細胞因子風暴”密切相關(guān)。細胞因子風暴易導致肺上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞的損傷，引起急性肺損傷(ALI)的病理改變，出現(xiàn)肺血管通透性增高、肺水腫等臨床表征[9-11]。已有研究根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中醫(yī)治療方案對COVID-19臨床輕、中度的病癥表現(xiàn)，建立了模擬人類COVID-19的動物模型，對熱炎寧合劑的有效性進行了實驗性評價。研究結(jié)果顯示，熱炎寧合劑能顯著降低模型動物的肺指數(shù)、肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)含量及血清胃動素含量，能夠顯著提升外周血CD8+T淋巴細胞和CD4+T 淋巴細胞百分比[12]。

以上研究說明熱炎寧合劑在改善2019-nCoV感染導致的急性炎癥及機體過度免疫反應(yīng)方面有很好的潛力，具有“治標”作用。同時本研究也對熱炎寧合劑中可能干擾病毒復(fù)制的化合物進行了篩選，以期找到“治本”的關(guān)鍵信息。因此，本研究以2019-nCoV復(fù)制過程中的重要水解酶3CLpro為對接靶點，以“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的24個關(guān)鍵化合物作為配體，采用分子對接技術(shù)篩選得到7個對3CLpro有潛在抑制作用的化合物，說明這些化合物在發(fā)揮抗COVID-19作用的同時，也具有抗病毒的潛力(見圖4)。

注：綠色為中藥；橙色為成分；藍色為靶點；紫色為KEGG代謝通路。圖4 熱炎寧合劑干預(yù)COVID-19的“成分-靶點-通路”預(yù)測網(wǎng)絡(luò)

綜上所述，本研究對熱炎寧合劑干預(yù)COVID-19的活性成分、靶點及通路進行了探索性研究，并篩選了抗2019-nCoV的活性成分。分析結(jié)果初步表明，熱炎寧合劑組方的半枝蓮和虎杖是“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中的重點中藥，其黃酮類成分如芹菜素、白楊素甲醚等是抗炎、抗病毒的主要成分。綜合代謝通路注釋結(jié)果說明熱炎寧合劑可通過多成分、多靶點、多通路的互作模式達到兼顧“治標”和“治本”的治療作用。