松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表達及表達譜分析

陳 昊, 羅巧玉, 馬秋雨, 初 旭, 袁 超, 劉 穎, 余 偉,吳松青, 王 榮, 梁光紅, 張飛萍, 胡 霞,*

(1. 福建農林大學林學院, 福州 350002; 2. 福建農林大學, 生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點實驗室, 福州 350002)

松墨天牛Monochamusalternatus，隸屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)墨天牛屬Monochamus，幼蟲蛀食衰弱木的樹干和大枝條，加劇樹勢衰弱，嚴重時甚至造成樹木死亡；成蟲通過取食健康松樹枝條補充營養(yǎng)，攜帶并傳播松材線蟲病(王玲萍, 2004; Wuetal., 2013)。松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus感染引起的嚴重林業(yè)病害，被稱為“松樹的癌癥”(寧眺, 2004; 張鍇等, 2010)，在我國的分布范圍已擴大至17個省市，造成巨大的林業(yè)經(jīng)濟損失，嚴重破壞了自然景觀和生態(tài)環(huán)境(潘宏陽等, 2009)。

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2)是藍色多酚氧化酶家族中的最大組成部分，底物范圍廣泛，可催化多種芳香化合物的氧化(Baldrian, 2006; 于孟蘭和倪金鳳, 2014)。漆酶也是兩大木質素酶系中的重要一類，在沒有過氧化氫的情況下，漆酶可以通過溶解氧直接氧化底物(池玉杰和伊洪偉, 2007)。漆酶在自然界廣泛存在，真菌、細菌、高等植物和昆蟲中均已找到漆酶(Hulloetal., 2001; Gavnholt and Larsen, 2002; Piscitellietal., 2011; Virketal., 2012)。物種不同，漆酶功能也各有不同。植物漆酶主要參與木質素的合成與降解(Gavnholt and Larsen, 2002)，細菌漆酶則具有黑色素生成、尿酸氧化、抗紫外線輻射等多種功能(Tamakietal., 2010; Yeetal., 2010)。真菌漆酶與色素生成和木質素降解等功能密切相關(Januszetal., 2013; Wang SNetal., 2018)，同時真菌漆酶還可以幫助真菌病原菌克服寄主植物抗性，使病菌免受丹寧酸等植物防衛(wèi)素的影響，從而增強其侵染能力(Kimetal., 1995)。

在昆蟲漆酶的研究中，根據(jù)其分布、表達能力和功能的不同主要分為漆酶1(Lac1)和漆酶2(Lac2)。昆蟲Lac2廣泛存在于昆蟲的角質層，并在蛹期和羽化階段高水平表達(Hattorietal., 2010)。Arakane等(2005)對赤擬谷盜Triboliumcastaneum漆酶2基因(TcLac2)進行了RNA干擾實驗(RNAi)，結果赤擬谷盜無法完成表皮硬化和色素沉著，羽化過程受到嚴重干擾。松墨天牛MaLac2的RNAi實驗取得與赤擬谷盜TcLac2相似的結果，表明MaLac2在松墨天牛表皮硬化、色素沉著中發(fā)揮了關鍵作用(Niuetal., 2008)。昆蟲Lac1則主要分布在昆蟲的腸道、馬氏管、唾液腺和脂肪體等部位(Amenyaetal., 2010; Futahashietal., 2010)；在赤擬谷盜、煙草天蛾Manducasexta、岡比亞按蚊Anophelesgamibiae、黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps和小菜蛾Plutellaxylostella等昆蟲中均發(fā)現(xiàn)了昆蟲Lac1基因，并認為其可能在食物消化、食物脫毒、離子代謝、自身免疫等方面發(fā)揮了重要作用(Dittmeretal., 2004; Arakaneetal., 2005; Gormanetal., 2008; Hattorietal., 2010; Wang ZHetal., 2018)。目前對松墨天牛Lac1的研究尚無報道，其結構、性質和功能是否與其他昆蟲漆酶一致均有待研究。

本研究基于課題組前期獲得的松墨天牛轉錄組數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，克隆獲得了松墨天牛MaLac1基因全長序列，并對其進行了生物信息學分析，繼而利用原核表達載體合成MaLac1蛋白，并通過qPCR檢測了MaLac1基因在松墨天牛不同生長發(fā)育階段腸道中的表達情況，該結果將為揭示松墨天牛MaLac1基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

馬尾松蟲害木采集于福建省連江琯頭鎮(zhèn)(26.150°N, 119.593°E)，將蟲害木鋸成長約1 m的木段，置于長×寬×高=1.5 m×1.5 m×1.0 m的養(yǎng)蟲籠內。低齡幼蟲采自蟲害木樹皮，此階段幼蟲蛀食韌皮部；老熟幼蟲和蛹直接采自受害馬尾松木段內松墨天牛幼蟲坑道及蛹室，此階段幼蟲蛀食木質部；成蟲則取自養(yǎng)蟲籠內羽化10 d的成蟲，用新鮮松枝喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度26～28℃，相對濕度70%～80%。

1.2 樣品總RNA的提取及cDNA的合成

取1.1節(jié)中松墨天牛低齡幼蟲、老熟幼蟲、蛹、雌成蟲和雄成蟲各10頭，在顯微鏡下切開頭部和尾部，再用昆蟲針挑出腸道，按照Trizol試劑說明書進行總RNA提取，RNA置于-80℃保存。以1 μg總RNA為模板，按照BestarTMqPCR RT Kit說明書配制逆轉錄反應體系，總體系為10 μL，合成cDNA第1鏈，在-20℃條件下保存，用于后續(xù)的定量表達分析。另取松墨天牛老熟幼蟲新鮮腸道組織，按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA第1鏈，用于基因中間片段擴增。

1.3 松墨天牛MaLac1基因中間片段的擴增

參照轉錄組序列信息(Wuetal., 2016)，根據(jù)注釋信息篩選出松墨天牛漆酶基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成引物(表1)，以1.2節(jié)中合成的松墨天牛老熟幼蟲新鮮腸道組織cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系(50 μL): ddH2O 15 μL, 2×Ex Taq Buffer(TaKaRa) 25 μL, dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL, Ex Taq(TaKaRa) 1 μL, cDNA第1鏈5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL。反應程序: 95℃預變性2 min; 94℃變性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環(huán)。參照DNA純化試劑盒(OMEGA)說明書，將產(chǎn)物切膠回收并純化。將純化產(chǎn)物連接至pMD18T載體，經(jīng)轉化后篩選陽性克隆，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并通過MEGA 6.0序列比對分析進行轉錄組序列驗證。

1.4 松墨天牛MaLac1基因的全長RACE

根據(jù)1.3節(jié)中松墨天牛MaLac1基因的中間片段序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計3條特異性5′RACE引物GSP-1, GSP-2和GSP-3和2條特異性3′RACE引物3′978-1和3′978-2分別克隆MaLac1基因的5′端序列和3′端序列(表1)。基因的5′RACE使用Superscript II RT 酶和引物GSP-1對總RNA合成目的基因cDNA第1鏈，再用RNase進行處理。采用DNA Purification System: GLASSMAX DNA Isolation Spin Cartridges完成對cDNA的純化，在其末端添加多聚C，再用引物GSP-2和鉚釘引物AAP進行PCR第1輪擴增。反應體系(50 μL): ddH2O 31.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-2 (10 μmol/L) 2 μL, Abridged Anchor Primer (10 μmol/L) 2 μL, dC-tailed cDNA 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反應程序: 94℃預變性2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 10 min, 共35個循環(huán)。之后用引物GSP-3與通用擴增引物AUAP進行第2輪巢式PCR。反應體系(50 μL): ddH2O 33.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-3 (10 μmol/L) 1 μL, AUAP或UAP (10 μmol/L) 1 μL, PCR稀釋產(chǎn)物 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反應程序與第一輪相同。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進行連接，轉化后對陽性克隆進行測序。

基因的3′RACE使用逆轉錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS Primer A對總RNA進行逆轉錄合成cDNA，之后用引物3′978-1和通用引物UPM配成的50 μL反應體系進行第1輪PCR擴增。擴增產(chǎn)物稀釋50倍后，用引物3′978-2和UPM進行第2輪PCR擴增，反應條件及程序同第1輪。將產(chǎn)物進行切膠回收純化，并與pMD18T連接，轉化后送至上海生工直接測序。

最后使用Vector NTI10.3.0軟件將測得的5′和3′末端序列和中間序列拼接，得到MaLac1基因的全長cDNA序列，通過NCBI比對分析預測出基因的起始和終止密碼子位置。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進行連接，轉化后對陽性克隆進行測序。陽性克隆的測序結果與cDNA序列比對來確定成功獲得了重組載體。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

下劃線序列GAATTG和CTCGAG分別為MfeⅠ和XhoⅠ酶切位點。The underlined sequences GAATTG and CTCGAG are the cleavage site ofMfeⅠandXhoⅠ, respectively.

1.5 松墨天牛MaLac1基因的生物信息學分析

使用DNAMAN軟件對目的基因編碼序列進行預測，并用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對松墨天牛MaLac1基因的最長開放閱讀框進行預測。通過ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)等軟件完成MaLac1基因編碼蛋白理化性質的預測；使用在線SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)軟件進行信號肽預測；用TMpredServer(https:∥embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)等軟件完成對MaLac1基因編碼蛋白質的跨膜結構和親水性預測；用SOPMA(http:∥scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)等軟件完成對MaLac1蛋白的二級結構和三級結構預測。通過NCBI檢索其他昆蟲Lac基因序列，用ClustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)軟件完成氨基酸序列比對，再用MEGA6.0軟件構建進化樹，并完成1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢測。

1.6 松墨天牛MaLac1蛋白的原核表達與純化

利用P1944F(包含MfeⅠ酶切位點)和P1944R(包含XhoⅠ酶切位點)(表1)，以pMD18T-MaLac1質粒為模板，擴增全長CDS(Met1-Leu502)，用MfeⅠ和XhoⅠ酶切后回收，連接至pET-32a載體多克隆位點5′EcoRⅠ-XhoⅠ3′之間。由于Lac基因中含有EcoRⅠ位點，故此處使用其同尾酶MfeⅠ進行載體構建。連接后轉化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞。測序鑒定PCR篩選后的重組質粒pET32a-MaLac1，并將鑒定好的重組質粒轉化至大腸桿菌Rosetta (DE3)中，進行菌落PCR，之后對質粒進行酶切鑒定。接種陽性克隆Rosetta(pET32a-MaLac1)至LB培養(yǎng)基，保持溫度為37℃，在220 r/min條件下震蕩過夜培養(yǎng)。 待OD600=0.4～0.6之間時，加入IPTG，最終濃度為0.5 mmol/L，在18℃條件下誘導表達10 h。離心收集經(jīng)超聲破碎至透亮的重組菌體(新芝超聲破碎儀，2號探頭，功率10%，超聲時間2 s，間歇時間2 s，循環(huán)進行4 min), 12 000 r/min 10 min離心，分別收集上清和沉淀，12% SDS-PAGE檢測融合蛋白可溶性。

將大腸桿菌Rosetta-pET32a-MaLac1菌株誘導后，用裂解緩沖液重懸，超聲洗滌離心后獲得包涵體，使用8 mol/L尿素將包涵體變性，然后緩慢地將變性后包涵體蛋白加入到復性緩沖液中，獲得復性后可溶MaLac1重組蛋白。離心取上清液與Ni-NTA柱結合，用洗滌緩沖液去除雜蛋白，并將目的蛋白從Ni柱上洗脫。用Millipore 15 mL 10 K(UFC910096)的超濾離心柱濃縮目的蛋白MaLac1，SDS-PAGE檢測蛋白純化時的各組分，確定融合蛋白的大小和純度。

1.7 松墨天牛MaLac1基因表達量的qPCR檢測

采用qPCR檢測MaLac1基因在松墨天牛低齡幼蟲、老熟幼蟲、蛹和雌雄成蟲腸道中的表達差異，上游引物為D-MaLac1-F，下游引物為D-MaLac1-R(表1)。以1.2節(jié)中合成的不同蟲態(tài)腸道cDNA為模板，選用在松墨天牛不同發(fā)育階段表達較穩(wěn)定的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因(馮波等, 2016)，其上游引物為D-GAPDH-F，下游引物為D-GAPDH-R(表1)。反應體系(20 μL): Bestar? SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 7 μL。反應程序: 95℃預變性2 min; 94℃變性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環(huán)，記錄相關數(shù)據(jù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

松墨天牛MaLac1基因表達結果按照2-△△CT方法進行數(shù)據(jù)處理(Livak and Schmittgen, 2001)，將所得數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20軟件的比較均值單因素方差分析(ANOVA)進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤顯示。

2 結果

2.1 松墨天牛MaLac1基因的克隆及序列分析

根據(jù)課題組前期獲得的松墨天牛轉錄組測序數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，篩選出松墨天牛漆酶保守序列信息，設計并合成引物。提取松墨天牛新鮮腸道組織總RNA(圖1: A)，逆轉錄合成cDNA作為模板，PCR擴增后得到該基因中間片段。根據(jù)獲得的松墨天牛漆酶基因保守序列分別設計目的基因的5′和3′RACE特異引物，進行PCR擴增克隆測序。根據(jù)中間片段序列、5′RACE和3′RACE結果進行序列拼接，獲得一條總長為2 395 bp的cDNA序列，其中編碼區(qū)長度為2 067 bp(圖1: B)，5′端非編碼區(qū)118 bp(圖1: C)，3′端非編碼區(qū)210 bp(圖1: D)，命名此基因為MaLac1(GenBank登錄號: KY073340)。MaLac1基因編碼一個含688個氨基酸的蛋白質，編碼蛋白分子量為78.34 kD，等電點為5.30。 信號肽預測結果表明，N端第1-15位氨基酸為信號肽區(qū)。MaLac1基因編碼多肽的原子組成為C3500H5306N940O1042S35，不穩(wěn)定系數(shù)是31.66，穩(wěn)定性強。MaLac1基因的編碼蛋白有80.15的脂肪系數(shù)，總平均親水性為-0.314，通過軟件ProtParam分析表明，MaLac1基因的編碼蛋白親水區(qū)域較多，為親水性蛋白。利用在線TMpred軟件對MaLac1基因編碼蛋白進行跨膜區(qū)分析，結果表明MaLac1基因編碼蛋白具有2個跨膜域和1個疑似跨膜域。每個跨膜結構域有17～18個氨基酸殘基。使用SOPMA等軟件和Swiss-model軟件分析MaLac1基因編碼蛋白質結構，結果表明MaLac1編碼蛋白二級結構中無規(guī)則卷曲占比57.99%，α-螺旋占比9.3%，β-折疊占比5.23%，α-螺旋與無規(guī)則卷曲間的伸展鏈占比27.47%,表明三級結構中構成蛋白質的主要骨架為無規(guī)則卷曲。

圖1 松墨天牛MaLac1基因全長的克隆Fig. 1 Full length cDNA cloning of MaLac1 in Monochamus alternatus1: 松墨天牛腸道總RNA Total RNA of M. alternatus gut; 2: MaLac1基因中間片段Intermediate fragment of MaLac1 (2 067 bp); 3: 5′ RACE片段5′ RACE fragment (167 bp); 4: 3′RACE片段3′ RACE fragment (269 bp); M: DL2000.

2.2 松墨天牛MaLac1蛋白與其他已知昆蟲漆酶基因序列比對及系統(tǒng)進化分析

使用ClustalX2.1軟件將MaLac1基因和其他15種昆蟲漆酶基因編碼氨基酸序列(物種名及其漆酶基因GenBank登錄號信息見圖2圖注)進行多重比對，結果顯示：MaLac1基因編碼產(chǎn)物與其他昆蟲漆酶類似，具有與銅離子結合有關的10個組氨酸和1個半胱氨酸，以及一段C-X-R-X-C區(qū)域，并在N末端具有若干個芳香族帶電殘基(Dittmeretal., 2004)；C-X-R-X-C區(qū)域一般擁有7個半胱氨酸，位于第一個銅離子結合組氨酸上游90個氨基酸的位置，并且在昆蟲漆酶蛋白中高度保守。使用MEGA6.0軟件對來源于15個昆蟲物種的漆酶基因構建系統(tǒng)進化樹(圖2)，結果顯示，MaLac1基因的氨基酸序列與赤擬谷盜Triboliumcastaneum漆酶基因TcLac1的氨基酸序列一致性為93%，具有較近的親緣關系；不同物種間Lac1基因與Lac2基因各自形成不同分支，說明同一類型的漆酶基因保守性更強。

圖2 鄰接法構建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆蟲Lac氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)Fig. 2 Phylogenetic tree of MaLac1 of Monochamus alternatus and Lac proteins of other insects based on amino acid sequence(neighbor-joining method, 1 000 repeats)Lac蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of Lac proteins and their GenBank accession numbers: MaLac1: 松墨天牛Monochamus alternatus (KY073340); AnLac1: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (XP_018580038); LdLac1: 馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (XP_023019016); NcLac1S: 黑尾葉蟬 Nephotettix cincticeps (AB514129); BtLac1: 煙粉虱 Bemisia tabaci (AQY62684); SoLac2: 米象 Sitophilus oryzae (XP_030755871); TcLac1: 赤擬谷盜 Tribolium castaneum (NP 001034514); AmLac1: 西方蜜蜂Apis mellifera (XP_026295929); SiLac1: 紅火蟻Solenopsis invicta (XP_025992935); MsLac1: 煙草天蛾 Manduca sexta (AAN17506); HaLac1: 棉鈴蟲 Helicoverpa armigera (AKH61981); DpLac1: 黑脈金斑蝶 Danaus plexippus (OWR44647); PxLac1: 小菜蛾Plutella xylostella (KR107969); AgLac1: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae (AY135184); MaLac2: 松墨天牛Monochamus alternatus (EU093075); TcLac2: 赤擬谷盜 Tribolium castaneum (AAX84202); MsLac2: 煙草天蛾Manduca sexta (AAN17507); RfLac6: 黃肢散白蟻Reticulitermes flavipes (GQ421909).

2.3 MaLac1基因的原核表達

SDS-PAGE電泳分析表明，在IPTG誘導下，含pET32a-MaLac1的大腸桿菌表達了一條大約78 kD的特異蛋白條帶(圖3: A)，符合推測大??；Ni柱親和層析純化蛋白結果顯示與表達蛋白大小一致(圖3: B)，通過純化最終得到復性蛋白(圖3: C)。

2.4 MaLac1在不同發(fā)育階段松墨天牛腸道中的表達量

qPCR結果顯示，MaLac1基因在松墨天牛腸道中廣泛表達，轉錄水平在不同發(fā)育階段存在顯著差異(F=6.82,P<0.05)。松墨天牛低齡幼蟲和老熟幼蟲腸道中MaLac1的表達水平相近，均顯著低于成蟲的(P<0.05)；在松墨天牛的蛹期腸道中，MaLac1的表達量增加，但仍顯著低于成蟲期的(P<0.05)；在松墨天牛的成蟲期，MaLac1在雌成蟲腸道中的表達量略高于雄成蟲的，均顯著高于幼蟲期和蛹期的(P<0.05)(圖4)。

圖3 松墨天牛MaLac1的原核表達及蛋白純化Fig. 3 Prokaryotic expression and protein purification of MaLac1 of Monochamus alternatusA: 重組載體pET32a-MaLac1的誘導表達Expression of pET32a-MaLac1. 1: 未經(jīng)IPTG的誘導pET32a-MaLac1的表達產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 non-induced by IPTG; 2: IPTG誘導后pET32a-MaLac1的表達產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 induced by IPTG; 3: 上清中pET32a-MaLac1的表達產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 in supernatant solution; 4: 包涵體中pET32a-MaLac1的表達產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 in inclusion body. B: pET32a-MaLac1表達的重組蛋白的純化 Purification of the recombinant protein expressed by pET32a-MaLac1. 5: 包涵體的裂解沉淀Sediment of inclusion body; 6: 包涵體的裂解上清Supernatant of inclusion body. C: MaLac1純化蛋白的復性Refolding of purified MaLac1 protein. 7: MaLac1復性蛋白Renaturated protein of MaLac1. M: 蛋白質分子量標準Protein molecular weight marker.

圖4 MaLac1在不同發(fā)育階段松墨天牛腸道中的表達分析Fig. 4 Expression profiles of MaLac1 in the gut ofMonochamus alternatus at differentdevelopmental stagesEL: 低齡幼蟲Early instar larva; ML: 老熟幼蟲Mature larva; PP: 蛹Pupa; FA: 雌成蟲Female adult; MA: 雄成蟲Male adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同字母分別代表不同蟲態(tài)腸道中基因表達量的差異顯著性(n=3)(P<0.05, LSD法)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level in the gut among different developmental stages (n=3)(P<0.05, LSD method).

3 討論

本研究通過篩選松墨天牛各發(fā)育階段轉錄組數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，獲得了一個松墨天牛內源漆酶基因，并將其命名為MaLac1。通過RACE技術成功獲得了MaLac1的全長cDNA，ORF全長2 067 bp，編碼一個含688個氨基酸的蛋白質，預測分子量為78.34 kD，等電點為5.30。與其他昆蟲漆酶的氨基酸序列比對顯示，MaLac1具有與銅離子結合有關的10個組氨酸和1個半胱氨酸、一段C-X-R-X-C密集區(qū)域、以及在N末端存在若干芳香族帶電殘基，這與昆蟲漆酶蛋白的典型特征相吻合(Dittmeretal., 2004)。系統(tǒng)進化分析表明該基因氨基酸序列與赤擬谷盜TcLac1基因氨基酸序列的一致性達到93%，具有較近的親緣關系。昆蟲Lac1氨基酸序列與昆蟲Lac2氨基酸序列各自形成一個分支，表明同一類型漆酶基因保守性較強。

本研究構建了MaLac1基因的原核表達載體pET32a-MaLac1，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞表達菌株，通過IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳結果顯示，最終產(chǎn)生了一條大約78 kD的特異蛋白條帶，符合推測大小，表明成功完成了pET32a-MaLac1的表達。最終通過Ni柱親和層析純化得到了復性蛋白，為下一步蛋白功能的研究奠定了基礎。

漆酶作為一種重要的木質素酶，其降解功能已在其他植食性昆蟲中被發(fā)現(xiàn)。Coy等(2010)對黃肢散白蟻的漆酶RfLac進行活性測定，發(fā)現(xiàn)RfLac對木質素單體芥子酸、鄰苯二酚等底物具有催化活性。煙草天蛾進行取食后，其漆酶基因MsLac1在中腸中大量表達，而在蟲體休眠后表達量降低，推測MsLac1可能與昆蟲木質素降解有關(Dittmeretal., 2004)。在MaLac1表達定量分析中，發(fā)現(xiàn)MaLac1在松墨天牛不同發(fā)育時期的腸道中廣泛表達，在成蟲中腸道中的表達量顯著高于幼蟲和蛹中的，推測其參與了宿主昆蟲的基本生理功能，可能在松墨天牛消化木質素的過程中發(fā)揮了一定作用。

岡比亞按蚊體內血液含量升高時，漆酶基因AgMCO1在中腸、馬氏管、卵巢中的表達量同時上升，表明AgMCO1可能與鐵代謝有關(Nicholetal., 2002; Gormanetal., 2008)。黑尾葉蟬漆酶基因NcLac1S在唾液腺中表達顯著，推測其可能與酚類化合物解毒有關(Hattorietal., 2010)。小菜蛾漆酶基因PxLac1在蟲體受到細菌感染后，轉錄水平顯著提升，也證明了Lac1具有參與昆蟲免疫的功能(Wang ZHetal., 2018)。因此，松墨天牛MaLac1可能具有食物脫毒、離子代謝、自身免疫等方面的生理功能。

單寧酸是一種在植物體內廣泛存在的天然多元酚化合物(Gardioletal., 1996; Wanetal., 2006)。單寧酸可以與唾液蛋白、糖蛋白等互作，產(chǎn)生苦澀味，從而降低動物采食量，影響蛋白質的消化吸收(邵婭等, 2017);另一方面，漆酶被認為可以通過對單寧酸的氧化作用，提高植食性昆蟲對寄主植物的抗性(李芒, 2011)。馬尾松健康木中單寧含量較高，而在受到昆蟲侵害時，隨著危害程度的加深，其單寧含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(史先慧等, 2017)。松墨天牛多選擇衰弱木、枯死木產(chǎn)卵，在幼蟲期大量進食，直至羽化；羽化后的成蟲則喜好取食健康松樹的嫩梢以補充營養(yǎng)。因此，松墨天牛成蟲在取食行為中將面臨較高的寄主植物抗性壓力，其MaLac1基因表達量的升高可能與氧化植物單寧酸，幫助昆蟲食物脫毒，克服寄主植物抗性有關。MaLac1在松墨天牛腸道中的具體作用還有待進一步研究驗證。

本研究克隆了松墨天牛MaLac1基因全長序列，解析了該基因的結構并預測其編碼蛋白生物學特性，完成了原核表達并純化目的蛋白，熒光定量PCR探明了MaLac1基因在松墨天牛不同生長發(fā)育階段的腸道中的表達差異，研究結果將有助于進一步探究松墨天牛漆酶的功能。