小麥全基因組抗赤霉病QTL關(guān)聯(lián)位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記的篩選、等位變異及效應(yīng)解析

吳迪, 鄭彤, 李磊, 李韜*

1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州 225007

小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由鐮刀菌(Fusariumgraminearumspecies complex)引起的在世界性范圍內(nèi)流行的一種破壞性病害[1]，通常發(fā)生在溫暖潮濕和半潮濕麥區(qū)，在我國(guó)主要發(fā)生長(zhǎng)江中下游和華南沿海冬麥區(qū)以及東北東部春麥區(qū)，危害面積600余萬(wàn)公頃，致病菌以禾谷鐮刀菌為主[2-3]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部最新農(nóng)情調(diào)查顯示，2019年發(fā)病面積約1千萬(wàn)公頃。赤霉病不僅可造成小麥減產(chǎn)高達(dá)10%～80%[4]，還會(huì)嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)和食用價(jià)值，若食物中脫氧腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)毒素(因赤霉病而產(chǎn)生的一種毒素)含量超標(biāo)會(huì)導(dǎo)致人畜中毒。培育抗病小麥品種是防控赤霉病大面積流行的最主要方法[5-6]。

許多研究表明小麥赤霉病抗性是由幾個(gè)主效基因和一些修飾基因共同控制的數(shù)量遺傳性狀[7-8]。分子標(biāo)記輔助選擇可在DNA水平針對(duì)抗赤霉病的基因或數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci，QTL)進(jìn)行選擇和聚合，提高抗病育種效率[9-10]。隨著分子輔助選擇育種的興起，根據(jù)研究的不斷進(jìn)展，研究人員開(kāi)發(fā)了許多赤霉病抗性相關(guān)標(biāo)記。目前主流的標(biāo)記主要有單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記。SNP標(biāo)記變異豐富，可高通量進(jìn)行分析，在基因或QTL快速定位中有很好的優(yōu)勢(shì)[11]，其缺點(diǎn)是絕大部分SNP標(biāo)記等位變異具有二態(tài)性，無(wú)法有效區(qū)分自然群體中的2個(gè)以上的等位變異，即便檢測(cè)到真實(shí)的SNP等位變異，用到育種中往往需要轉(zhuǎn)化成基于PCR的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitive allele-specific PCR，KASP)標(biāo)記[12]或酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences/derived cleaved amplified polymorphic sequences，CAPs/dCAPs)標(biāo)記[13]，且均需要額外的引物設(shè)計(jì)，增加成本；SSR標(biāo)記的缺點(diǎn)是通量低，但具有共顯性、多態(tài)性高、數(shù)量豐富且易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，可以區(qū)分自然群體中目標(biāo)位點(diǎn)2個(gè)以上的等位變異，這點(diǎn)較SNP具有明顯的優(yōu)勢(shì)。不論是SSR標(biāo)記還是SNP標(biāo)記，大部分標(biāo)記中并不只存在于特定染色體的特定位置上，存在多拷貝現(xiàn)象，多拷貝的標(biāo)記在染色體上的位置可能不同，其位置的復(fù)雜性會(huì)影響標(biāo)記效應(yīng)分析的準(zhǔn)確程度，給分子標(biāo)記輔助育種帶來(lái)困擾和不確定性。

由于小麥基因組和赤霉病抗性的雙重復(fù)雜性，絕大部分控制赤霉病抗性的遺傳定位停留在QTL水平，QTL區(qū)段中具有較多的SSR，因此，本研究首先基于小麥品種中國(guó)春參考序列 (IWGSC RefSeq V1.0)[16]對(duì)小麥全基因組赤霉病抗性相關(guān)的SSR關(guān)聯(lián)標(biāo)記進(jìn)行拷貝數(shù)分析，篩選位點(diǎn)特異的單拷貝SSR標(biāo)記，旨在提高分子輔助選擇育種的針對(duì)性和效率。此外，赤霉病抗性是多個(gè)位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，已有研究表明，抗性品種仍可能攜帶感病基因，而感病品種也可能攜帶抗病變異，一個(gè)品種的赤霉病抗性表型是由有利等位變異和不利等位變異的數(shù)量和效應(yīng)共同決定[17-18]。為此，本研究在自然群體(由地方品種和育成品種組成)中對(duì)單拷貝SSR標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，再將獲得的基因型數(shù)據(jù)結(jié)合表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選與表型顯著關(guān)聯(lián)的單拷貝SSR標(biāo)記，接著計(jì)算關(guān)聯(lián)顯著標(biāo)記位點(diǎn)上的等位變異，根據(jù)等位變異對(duì)抗性表型的貢獻(xiàn)，將不同的等位變異分為有利(抗病)等位變異、不利(感病)等位變異以及中性(無(wú)效)等位變異，解析群體中不同品種的抗性組成。期望本研究可為赤霉病育種提供檢測(cè)標(biāo)記以及該標(biāo)記位點(diǎn)上的有利等位變異，方便育種家利用標(biāo)記進(jìn)行赤霉病輔助育種，提高育種效率，最終保障糧食安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑：DNA提取試劑均購(gòu)自揚(yáng)州市宏澤生物有限公司。PCR反應(yīng)體系中的MgCl2、Buffer、dNTP、Taq酶均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，引物設(shè)計(jì)來(lái)自南京擎科生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用儀器：2720 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.2 植物材料和赤霉病接種鑒定

由156個(gè)品種組成自然群體，包括40個(gè)中國(guó)地方品種、57個(gè)中國(guó)推廣品種、25個(gè)美國(guó)品種、24個(gè)日本品種、10個(gè)其他國(guó)家品種。

將該群體連續(xù)三季分別在大田(分別命名為F1、F2、F3)和溫室(分別命名為G1、G2、G3)中種植。在小麥揚(yáng)花期，采用單花滴注法接種Fg65菌系，接種的孢子濃度為4×105個(gè)·mL-1，接至倒數(shù)第3個(gè)小穗單側(cè)的小花上，每個(gè)小花注射量為10 μL。接種21 d后鑒定病小穗率(percentage of symptomatic spikelets, PSS)，病小穗率=感染小穗數(shù)/總小穗數(shù)。接種小穗有明顯感病癥狀并且病菌成功侵染穗軸(穗軸變褐色)，接種即成功。通過(guò)計(jì)算病小穗率來(lái)判斷赤霉病的嚴(yán)重程度。這些品種基于赤霉病的嚴(yán)重程度分為4個(gè)等級(jí)：高抗(0

1.3 赤霉病抗性相關(guān)分子標(biāo)記及其引物序列查找

由于小麥赤霉病抗性相關(guān)QTL在全基因組均有分布，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[19-33]，統(tǒng)計(jì)了小麥21條染色體上分布的赤霉病抗性相關(guān)SSR標(biāo)記共386個(gè)，并利用GrainGenes(http://wheat.pw.usda.gov)得到386個(gè)標(biāo)記的引物序列，同時(shí)分析了這些標(biāo)記在染色體上的位置和標(biāo)記區(qū)間等信息。

1.4 本地化數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的構(gòu)建及使用

構(gòu)建數(shù)據(jù)提取系統(tǒng)用Perl語(yǔ)言平臺(tái)，版本為ActivePerl 5.14.2 (http://www.activestate.com/activeperl)，語(yǔ)言模塊選擇BioPerl(http：//www.bioperl.org)，包括獲取數(shù)據(jù)、分析序列、比對(duì)序列、數(shù)據(jù)挖掘等[34-35]。

本地化BLAST軟件從NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/cgi)下載安裝[36]。用formatdb格式化FASTA格式的序列文件，按照BLAST系統(tǒng)要求建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.5 e-PCR的模擬擴(kuò)增

本研究所使用的是NCBI網(wǎng)站上e-PCR程序，參數(shù)設(shè)置如下：字長(zhǎng)為9，不連續(xù)字長(zhǎng)為1，命中產(chǎn)物最大允許偏差為100，最大允許錯(cuò)配和最大允許插入缺失為1。參數(shù)設(shè)置完畢后，根據(jù)統(tǒng)計(jì)的386個(gè)小麥全基因組抗赤霉病相關(guān)標(biāo)記的序列，進(jìn)行e-PCR，根據(jù)結(jié)果得到標(biāo)記所在的物理位置，與參考組比對(duì)，有且只能匹配1個(gè)位點(diǎn)的標(biāo)記，即單拷貝標(biāo)記。

1.6 基因型分析

以小麥幼苗葉片為提取材料，采用CTAB法[37]提取試驗(yàn)品種的基因組DNA。利用抗性相關(guān)的386個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)[38]。反應(yīng)體系(20 μL)為：模板DNA 2 μL，10×MgCl21.8 μL，10×TransBuffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，前引物0.4 μL，后引物0.4 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水定容至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火(退火溫度根據(jù)不同的引物有所不同)30 s，72 ℃延伸45 s(延伸時(shí)間根據(jù)片段長(zhǎng)度有所不同)，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取15 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，記錄基因型數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

群體結(jié)構(gòu)由STRUCTURE 2.3.4來(lái)確定。TASSEL V4.3.1用于鑒別病小穗率關(guān)聯(lián)顯著標(biāo)記，使用混合線性模型y=Xβ+Qv+Zu+Ew[38]，其中，X為基因型數(shù)據(jù)，β為效應(yīng)值，Q為群體結(jié)構(gòu)，v為固體效應(yīng)值，Z為親緣關(guān)系，u為隨機(jī)效應(yīng)值，E為殘差，w為殘差效應(yīng)值。等位變異效應(yīng)值(NAV)計(jì)算使用pi=∑xij/ni-x，其中，pi表示第i個(gè)等位變異表型效應(yīng)，xij表示第j個(gè)攜帶第i個(gè)等位變異品種的病小穗率，ni表示攜帶第i個(gè)等位變異的品種數(shù)量，x是標(biāo)記位點(diǎn)上攜帶不同等位變異品種病小穗率的總平均值。等位變異效應(yīng)分析參照Li 等[17]文章中分析方法。在α=0.05條件下，有利等位變異組合之間的多重比較使用Turkey法，由Matlab軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記在QTL位點(diǎn)上的分布

通過(guò)文獻(xiàn)搜索[19-33]和本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)繪制了基于SSR標(biāo)記的小麥赤霉病抗性QTL圖譜，386個(gè)赤霉病抗性相關(guān)SSR標(biāo)記在小麥21條染色體上均有分布，將這些標(biāo)記分為多拷貝和單拷貝標(biāo)記，其在QTL位點(diǎn)上的相對(duì)位置以及其抗性區(qū)間如圖1所示。這些單拷貝標(biāo)記可作為目標(biāo)QTL基因型分析和標(biāo)記輔助選擇的首選標(biāo)記。

2.2 自然群體赤霉病的表型差異

為了驗(yàn)證標(biāo)記在自然群體中的效應(yīng)，對(duì)大田和溫室各三季田間試驗(yàn)進(jìn)行表型鑒定，統(tǒng)計(jì)了赤霉病PSS，基于這些表型數(shù)據(jù)的分析，將品種分為高抗品種、中抗品種、中感品種和高感品種。圖2和圖3分別為溫室和大田環(huán)境下品種抗感分布堆積圖。如圖2所示，本實(shí)驗(yàn)選取的156個(gè)品種在溫室環(huán)境下，中國(guó)的地方品種的赤霉病抗性優(yōu)于推廣品種，而日本品種的抗性普遍較好，美國(guó)品種的抗性比較一般。

注：黑色實(shí)心部分代表抗性相關(guān)QTL；斜體加粗為單拷貝標(biāo)記；其他為多拷貝標(biāo)記。圖1 小麥全基因組赤霉病抗性QTL區(qū)間、關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記及其拷貝數(shù)Fig.1 Genomwide QTL intervals for wheat scab resistance, associated SSR markers and their copy number

在三季大田試驗(yàn)中(如圖3所示)，中國(guó)地方品種在高感、中感、中抗、高抗中分布的頻率分別是0.125、0.3、0.25、0.325；中國(guó)推廣品種分布的頻率為0.2、0.36、0.32、0.12；日本品種分布的頻率為0.04、0.21、0.25、0.5；美國(guó)品種分布的頻率為0.24、0.4、0.24、0.12。根據(jù)大田試驗(yàn)各國(guó)家地區(qū)品種的表型分析，本研究得到與溫室試驗(yàn)相同的結(jié)論，即在中國(guó)品種中，地方品種的赤霉病抗性優(yōu)于推廣品種，而大部分日本品種都能達(dá)到中抗或者高抗水平，美國(guó)品種抗性較為一般。

2.3 顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記

利用篩選出的分布在小麥21條染色體上的單拷貝SSR標(biāo)記在自然群體中進(jìn)行檢測(cè)，分別結(jié)合大田和溫室共六季的病小穗率以及病小穗率平均值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)P<0.05即為顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記。

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(表1)可知，共有8個(gè)單拷貝標(biāo)記在超過(guò)兩季試驗(yàn)中出現(xiàn)且與表型顯著關(guān)聯(lián)。其中，單拷貝標(biāo)記gwm157、wmc363、gwm334、gwm533在大田和溫室環(huán)境下都與表型顯著關(guān)聯(lián)，說(shuō)明這類標(biāo)記位點(diǎn)上的效應(yīng)受環(huán)境影響較小。而標(biāo)記barc117只在溫室環(huán)境下與表型關(guān)聯(lián)顯著，標(biāo)記barc196、wmc477、wmc479只在大田環(huán)境下與表型關(guān)聯(lián)顯著，說(shuō)明此類標(biāo)記位點(diǎn)上的效應(yīng)可能受到環(huán)境因素的制約。

圖2 三季溫室試驗(yàn)赤霉病病小穗率分布圖Fig.2 Frequencies of phenotypic distributions of severity for three seasons in greenhouse

圖3 三季大田試驗(yàn)赤霉病病小穗率分布圖Fig.3 Frequencies of phenotypic distributions of severity for three seasons in field

表1 關(guān)聯(lián)顯著的單拷貝標(biāo)記在各季的表型解釋率Table 1 Phenotypic variance explained by single-copy SSR markers significantly correlated with FHB in each season

注：G1、G2、G3表示溫室鑒定，F(xiàn)1、F2、F3為大田鑒定；ns表示標(biāo)記未與當(dāng)前季表型關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

2.4 位點(diǎn)特異性顯著關(guān)聯(lián)SSR標(biāo)記位點(diǎn)上等位變異的分布

為了計(jì)算關(guān)聯(lián)顯著標(biāo)記位點(diǎn)上的等位變異，首先要確定等位變異是否有效。當(dāng)T的絕對(duì)值小于2時(shí)，認(rèn)為該等位變異為無(wú)效等位變異；當(dāng)T的絕對(duì)值大于2時(shí)，認(rèn)為該等位變異為有效等位變異。有效等位變異分為有利和不利等位變異。當(dāng)T值小于0時(shí)，為有利等位變異；當(dāng)T值大于0時(shí)，為不利等位變異(表2)。在8個(gè)重復(fù)性較好的單拷貝關(guān)聯(lián)顯著的標(biāo)記中，有5個(gè)標(biāo)記存在8個(gè)有效等位變異，包括3個(gè)有利等位變異和5個(gè)不利等位變異。如表3所示，2個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上(wmc477、barc117)同時(shí)存在有利和不利等位變異，5B染色體上標(biāo)記wmc363存在2個(gè)不利等位變異。如表2所示，含有利等位變異數(shù)量較多的品種赤霉病抗性基本到達(dá)中抗水平，含不利等位變異數(shù)量較多的品種都達(dá)到中感，大部分高感。

表2 關(guān)聯(lián)標(biāo)記的等位變異Table 2 Allelic variations of the associated markers

注：下劃線為有效等位變異；R表示抗病等位變異；S表示感病等位變異。

2.5 特異性標(biāo)記位點(diǎn)上攜帶不同有利等位變異品種的病小穗率差異

為了解析群體中不同品種的抗性組成，分析各品種中有利等位變異的分布情況以及病小穗率情況。由表2可知，在本研究中，共3個(gè)單拷貝標(biāo)記位點(diǎn)上存在有利等位變異，分別為wmc477、barc117、wmc479。如表3所示，在中國(guó)地方品種和日本品種中攜帶較多有利等位變異，而中國(guó)地方品種與日本品種在六季表型試驗(yàn)中赤霉病抗性表現(xiàn)也是最好的。

3個(gè)單拷貝標(biāo)記上共含有3個(gè)有利等位變異位點(diǎn)，在156個(gè)品種中，52個(gè)品種含有1個(gè)有利等位變異，這些品種平均病小穗率達(dá)到0.538；29個(gè)品種含有2個(gè)有利等位變異，平均病小穗率達(dá)到0.436；19個(gè)品種含有3個(gè)有利等位變異，平均病小穗率達(dá)到0.377。這說(shuō)明含有有利等位變異的數(shù)量越多，品種的抗性越好。

表3 有利等位變異在品種的分布Table 3 Distributions of the favorable allelles in varieties from different sources

3 討論

赤霉病已成為影響我國(guó)小麥安全生產(chǎn)的主要病害之一，對(duì)赤霉病抗性基因/QTL進(jìn)行定位，并挖掘關(guān)聯(lián)的鑒別標(biāo)記，對(duì)培育赤霉病抗性品種無(wú)疑具有重要的意義。單拷貝標(biāo)記在基因定位、單倍型分析和標(biāo)記輔助選擇方面具有重要的優(yōu)勢(shì)。本研究首先從已發(fā)表的文獻(xiàn)中搜集與赤霉病抗性關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，進(jìn)一步對(duì)這些標(biāo)記的拷貝數(shù)進(jìn)行分析，篩選單拷貝標(biāo)記，利用這些單拷貝標(biāo)記對(duì)自然群體進(jìn)行分型分析，結(jié)合多季的抗病表型鑒定，篩選出與赤霉病抗性QTL位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的8個(gè)單拷貝標(biāo)記，解析了這些標(biāo)記的有效等位變異及其品種分布，發(fā)現(xiàn)品種的抗性明顯受環(huán)境因素的影響外，不同QTL位點(diǎn)上有利等位變異和不利等位變異的數(shù)目和效應(yīng)共同決定品種的赤霉病抗性。品種中含有利等位變異越多，品種的抗性越好。因此，在提高育成品種抗性的過(guò)程中，在引入有利等位變異的同時(shí)剔除其他位點(diǎn)上的不利等位變異，預(yù)期可以大大提升品種的抗性水平并提高育種效率。

本研究鑒定的QTL位點(diǎn)、關(guān)聯(lián)的單拷貝SSR標(biāo)記、有效等位變異以及載體品種可用于赤霉病抗性改良。但不足之處在于目前與赤霉病關(guān)聯(lián)的已知單拷貝SSR標(biāo)記數(shù)量偏少，可能是導(dǎo)致定位出的位點(diǎn)數(shù)偏少的原因之一。隨著小麥參考組基因的完善和更多小麥近緣種的測(cè)序，可以挖掘更多單拷貝SSR標(biāo)記，同時(shí)結(jié)合赤霉病表型精準(zhǔn)鑒定，預(yù)期可以提高主效QTL的檢出數(shù)目、縮小QTL區(qū)間、準(zhǔn)確評(píng)估QTL及等位變異的效應(yīng)，有利于進(jìn)一步提高標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確度、提高育種效率和提升品種的抗性水平，最終有利于降低赤霉病危害，保障小麥安全生產(chǎn)以及糧食安全。