miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和遷移的影響*

杜喜風(fēng)， 胡志輝， 景敏潔， 王雅婷， 蘭麗珍

（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西太原030001）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，且近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。約有10%～15%的PTC患者常出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致其標(biāo)準(zhǔn)治療的效果較差，預(yù)后不佳［1］。因此，研究PTC形成和發(fā)展的分子機(jī)制是十分必要的，對(duì)尋找PTC治療新藥，提高PTC患者的預(yù)后具有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中由基因組編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，通過(guò)和靶基因mRNA堿基完全或不完全配對(duì)進(jìn)而誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和代謝等基本的生理過(guò)程［2］。大量研究已經(jīng)證實(shí)，異常表達(dá)的 miRNA 如 miR-105［3］、miR-300［4］等能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種致癌或抑癌基因的表達(dá)，從而調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-206 在多種癌癥中如乳腺癌［5］、肝癌［6］、胃癌［7］、喉癌［8］等有異常表達(dá)，表明它與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-206的表達(dá)量在PTC組織中較正常組織中低。但miR-206對(duì)PTC具體生物功能及機(jī)制尚未闡明。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）的受體c-Met是原癌基因編碼的一種190 kD的蛋白，是具有確定的致癌特性的受體酪氨酸激酶，在正常細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用。c-Met與HGF結(jié)合后，引起受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化，激活蛋白激酶，導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化并激活PI3K/Akt/mTOR通路［10］。異常激活的c-Met/Akt/mTOR信號(hào)通路與甲狀腺癌、宮頸癌等多種惡性細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)［11-12］。然而，在PTC中，miR-206能否通過(guò)抑制c-Met/Akt/mTOR信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌作用，鮮有相關(guān)報(bào)道。本研究旨在研究miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)PTC細(xì)胞增殖和遷移的影響并探索其可能的機(jī)制，為PTC臨床靶向治療篩選新的分子干預(yù)靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要試劑

人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購(gòu)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)中心。DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone；澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自 CellMax；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen；TRIzol試劑購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；CCK-8和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Transwell小室購(gòu)自Corning；hsa-miR-206模擬物（hsa-miR-206 mimic）和陰性對(duì)照無(wú)關(guān)序列均購(gòu)自上海吉瑪基因；反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自GeneCopoeia；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega；抗 c-Met、p-Met、AKT、p-AKT、mTOR、pmTOR和β-actin抗體均購(gòu)自上海生工。

2 主要方法

2.1 K1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 K1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為3組，即空白（blank）組（未行任何轉(zhuǎn)染）、陰性對(duì)照（miR-NC）組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列miR-NC）和實(shí)驗(yàn)組（miR-206 mimic組；轉(zhuǎn)染miR-206 mimic）。在轉(zhuǎn)染前1 d，對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行傳代，且更換為無(wú)雙抗的培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)9.0×105個(gè)K1細(xì)胞均勻接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約70%時(shí)，再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM3000使用說(shuō)明書，吸取miR-206 mimic和miR-NC（濃度均為50μmol/L）各4μL，溶解于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)液為A液，同時(shí)吸取LipofectamineTM3000試劑4μL，溶解于100μL Opti-MEM培養(yǎng)液為B液，均靜置5 min。A液和B液混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，總體積為2 mL。于37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol法提取上述各組細(xì)胞的總RNA，測(cè)定RNA的濃度及純度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)miR-206表達(dá)量。引物均購(gòu)自上海生工。miR-206的上游引物序列為5′-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；內(nèi)參照U6的上游引物序列 為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。反應(yīng)體系包括：Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑10μL，模板cDNA 2μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各0.4μL，無(wú)RNA酶的雙蒸水7.2μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果得出Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組miR-206的相對(duì)表達(dá)水平，以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果。

2.3 CCK-8和活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組K1細(xì)胞分別接種于96孔板，細(xì)胞密度為每孔3×103個(gè)，每孔100μL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。分別將細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48和72 h后，終止培養(yǎng)；向各孔中加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（A450）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用0.04%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)各組消化后的細(xì)胞染色，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)（活細(xì)胞數(shù)=總細(xì)胞數(shù)-著色的死細(xì)胞數(shù)），每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集上述轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組K1細(xì)胞，計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞，用200μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、含5%CO2的孵箱中孵育24 h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定下層細(xì)胞20 min，PBS洗3次；再用0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min，PBS洗3次；小室干燥后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。以穿膜細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-206對(duì)c-Met基因的靶向作用 用TargetScan 7.1（www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè) miR-206 與其靶基因 3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′UTR）的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)GenePharma合成野生型（pGL3-c-Met-3′UTR WT）和突變型（pGL3-c-Met-3′UTR MUT）c-Met螢光素酶報(bào)告載體。將K1細(xì)胞接種在24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞密度約90%時(shí)，使用LipofectamineTM3000將 pGL3-c-Met-3′UTR WT 或 pGL3-c-Met-3′UTR MUT與miR-206 mimic或miR-NC共同轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后，按雙螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提供的方法，在單光子檢測(cè)儀上檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組K1細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液抽提細(xì)胞全蛋白，冰上靜置30 min，離心后取上清液。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。使用含5%脫脂奶粉和Tween 20的磷酸鹽緩沖液室溫封閉，分別加入對(duì)應(yīng)I抗，4℃過(guò)夜孵育；加入HRP標(biāo)記的II抗。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Quantity One分析軟件測(cè)定目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參照（β-actin）的灰度值，取其比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組K1細(xì)胞中miR-206的相對(duì)表達(dá)量升高

K1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白組和陰性對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組miR-206的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-206 in the PTC K1 cells transfected with miR-206 mimic.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖1 miR-206在甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞中的表達(dá)水平

2 過(guò)表達(dá)miR-206抑制K1細(xì)胞的增殖能力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的實(shí)驗(yàn)組中K1細(xì)胞的活力較空白組和陰性對(duì)照組明顯受到抑制（P＜0.01），見圖2A。在活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組存活K1細(xì)胞的數(shù)目較空白組和陰性對(duì)照組均明顯減少（P＜0.01），見圖2B。

3 過(guò)表達(dá)miR-206抑制K1細(xì)胞的遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于空白組和陰性對(duì)照組（P＜0.01），見圖3。這表明過(guò)表達(dá)miR-206可抑制K1細(xì)胞的遷移能力。

Figure 2.The effect of miR-206 over-expression on the proliferation ability of PTCK1 cells.A：the cell viability was measured by CCK-8 assay；B：the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖2 miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 3.The effect of miR-206 over-expression on the migration ability of PTC K1 cells（crystal violet staining，×100）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖3 miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞遷移能力的影響

4 K1細(xì)胞中miR-206靶向調(diào)控c-Met基因

通過(guò)TargetScan 7.1軟件檢索miR-206的靶基因，發(fā)現(xiàn)c-Met基因的3′UTR上存在1個(gè)潛在的miR-206結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在K1細(xì)胞中，與空白組（0.97±0.07）和陰性對(duì)照組（0.96±0.03）相比，miR-206過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制野生型c-Met3′UTR的相對(duì)螢光素酶活性（0.51±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；當(dāng)c-Met基因3′UTR中的miR-206結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)靶基因的抑制作用消失，即miR-206 mimic轉(zhuǎn)染組的相對(duì)螢光素酶活性（0.99±0.08）與空白組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖4B。以上結(jié)果充分說(shuō)明，miR-206通過(guò)與c-Met基因的3′UTR相互作用，負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達(dá)。

Figure 4.c-Met gene was directly targeted by miR-206 in PTC K1 cells.A：schematic diagram of c-Met 3′UTR targeted by miR-206；B：luciferase activity of the WTc-Met 3′UTR was dramatically inhibited in miR-206 mimic group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖4 c-Met是miR-206的靶基因

5 過(guò)表達(dá)miR-206可抑制K1細(xì)胞c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的K1細(xì)胞中，p-Met、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平與空白組和陰性對(duì)照組相比均明顯降低（P＜0.01），而其總蛋白均未見明顯改變，見圖5。這提示miR-206過(guò)表達(dá)可抑制c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制K1細(xì)胞的增殖和遷移能力。

Figure 5.The protein levels of c-Met，p-Met，AKT，p-AKT，mTOR and p-mTOR after transfection with miR-206 mimic in PTCK1 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖5 轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，各組K1細(xì)胞中c-Met/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

討 論

甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，女性發(fā)病率較男性高。而PTC為最常見的甲狀腺癌病理類型，約占甲狀腺癌的84%，它起源于濾泡上皮細(xì)胞，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［13］。miRNA是一類與惡性腫瘤密切相關(guān)的基因調(diào)控因子，且前期研究表明，多種miRNA在PTC細(xì)胞中均表達(dá)異常。miR-138-5p可能通過(guò)依賴性抑制LRRK2進(jìn)而抑制PTC細(xì)胞增殖［14］；miR-497通過(guò)直接靶向調(diào)節(jié)AKT3抑制PTC細(xì)胞的活力和遷移［15］。盡管許多研究者對(duì)miRNA在PTC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用進(jìn)行了大量研究，但由于其復(fù)雜性，PTC具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。

研究表明，miR-206可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等基本過(guò)程［16］。在許多人類惡性腫瘤中，miR-206發(fā)揮抑癌因子作用，例如在兒童急性髓系白血病中，miR-206通過(guò)靶向細(xì)胞周期蛋白D1發(fā)揮抑癌作用［17］；在前列腺癌細(xì)胞中，miR-206 與 ANXA2 mRNA結(jié)合可能調(diào)控EMT信號(hào)通路，從而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移［18］。本研究通過(guò)對(duì)PTCK1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 mimic，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組miR-206的相對(duì)表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組顯著升高，表明轉(zhuǎn)染成功。采用CCK-8和活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn)K1細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯受到抑制，表明miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖和遷移能力。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，在細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［19］。c-Met與HGF相結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自身磷酸化，可激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移等生物學(xué)反應(yīng)［20］。Zheng等［7］發(fā)現(xiàn) miR-206 可通過(guò)調(diào)控 c-Met基因表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖及遷移。在肝癌中，miR-206亦可靶向調(diào)控功能靶點(diǎn)c-Met和Cdk6，以介導(dǎo)其抑癌作用［21］。有研究表明，95%以上的PTC組織中發(fā)現(xiàn)c-Met蛋白高表達(dá)［22］。本研究結(jié)果顯示，在K1細(xì)胞中，miR-206通過(guò)與c-Met基因的3′UTR相互作用，進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達(dá)；且證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-206后，p-Met、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平均降低。這提示K1細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制，可能是由過(guò)表達(dá)miR-206降低c-Met蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制下游AKT/mTOR信號(hào)通路的激活所致。

綜上所述，miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的增殖和遷移能力，其作用機(jī)制可能與miR-206抑制c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)。這不僅為研究miR-206抑制PTC增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且miR-206/c-Met或可成為PTC臨床靶向治療中一個(gè)新的分子干預(yù)靶點(diǎn)。