白頭翁皂苷A通過調(diào)控miR-24-3p/RNF2的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞增殖及放射敏感性*

鄒曉靜， 郝燕燕△， 胡一迪， 謝燊俠， 白 薇

（溫州市中醫(yī)院 1檢驗科，2甲乳外科，浙江溫州325000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前治療主要 以手術(shù)結(jié)合放化療為主，但化療易耐藥及放射不敏感是困擾臨床的重要問題［1］，因此尋找有效治療乳腺癌的藥物及增強(qiáng)放化療敏感性的藥物是目前研究的重點。研究表明，中藥治療乳腺癌具有毒副作用小、效果好等特點，對乳腺癌的預(yù)防效果顯著，且一些中藥對腫瘤細(xì)胞具有放療增敏的效果［2］。白頭翁是一種中草藥，具有抗腫瘤、抗氧化及促進(jìn)免疫等作用［3］。且研究報道白頭翁皂苷D體外可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡［4］；白頭翁皂苷A（Pulsatilla saponin A）可抑制人非小細(xì)胞肺癌的生長，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性［5］。此外，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）也與腫瘤的發(fā)展和放療敏感性相關(guān)，如miR-24-3p可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性［6］，miR-24-3p可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲［7-8］。然而白頭翁皂苷A在體外對乳腺癌細(xì)胞增殖及放射敏感性的影響還尚未見報道。因此，本研究擬探討白頭翁皂苷A對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與miR-24-3p有關(guān)。

材料和方法

1 材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液（Gibco）；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR?Green Mix（Vazyme）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen）；MTT、蛋白提取試劑盒和BCA試劑盒（上海碧云天公司）；白頭翁皂苷A（湖北萬得化工有限公司）；miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p載體質(zhì)粒（上海吉瑪生物公司）。［60Co］醫(yī)療照射裝置（中國核動力研究院）。

2 白頭翁皂苷A儲存液的配制

稱取白頭翁皂苷A 0.668g，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液33.4 mL，配成濃度為20 mg/L的儲存液，攪拌均勻后，抽濾無菌培養(yǎng)，-20℃避光保存，使用時按所需濃度按比例稀釋。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 參考彭超軍［5］的實驗方法，取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，接種于96孔板（每孔1×104個）培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，換成終濃度分別為0、5、10、15和20 mg/L的白頭翁皂苷A的DMEM培養(yǎng)液，記為不同濃度白頭翁皂苷A處理組。不添加白頭翁皂苷A的作為對照組，以終濃度為10 mg/L的白頭翁皂苷A培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，記作白頭翁皂苷A組。

取常規(guī)培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)液同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-24-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

取部分anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組的細(xì)胞分別加10 mg/L的白頭翁皂苷A培養(yǎng)48 h，記為白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組和白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組。

3.3 MTT法測定白頭翁皂苷A對乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力的影響 取以上各組細(xì)胞，在其培養(yǎng)至48 h時每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h，加入150μL的DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A450）值。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔取均值，將對照組細(xì)胞抑制率設(shè)定為0%。其余各組細(xì)胞抑制率（%）=（1-實驗組A/空白對照組A）×100%。

3.4 集落形成實驗 取對照組、白頭翁皂苷A組、白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組、白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組、miR-NC組和miR-24-3p組細(xì)胞，分別給予0、2、4、6和8 Gy的［60Co］照射。照射后，按照射劑量大小分別以 0.3×103、1×103、1×103、3×103和 3×103的細(xì)胞密度接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)＞50個細(xì)胞的集落。平板效率（plating efficiency，PE；%）=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。存活分?jǐn)?shù)（survial fraction，SF）=照射劑量組集落數(shù)（/該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE）。采用多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×ln N。其中D為照射劑量（Gy），D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)閾劑量（代表存活的寬肩度），N為外推值。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）=單純照射組D0/加藥聯(lián)合照射組D0。

3.5 RT-qPCR分析miR-24-3p和環(huán)指蛋白2（ring finger protein 2，RNF2）的mRNA表達(dá)水平 按照TRIzol說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照AceQqPCR SYBR?Green Mix說明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。循環(huán)條件為：95℃30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。實驗均重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

3.6 Western blot檢測RNF2蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量60μg，SDS-PAGE后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入相對應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影，定影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的A值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。實驗均重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

3.7 螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-24-3p對RNF2的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示RNF2的3′-UTR有miR-24-3p的結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型RNF2的3′-UTR螢光素酶表達(dá)載體（WT-RNF2和MUT-RNF2），取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞接種于24孔板（每孔1×103個），待細(xì)胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-RNF2和MUT-RNF2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時分別轉(zhuǎn)染miR-24-3p和miR-NC。依據(jù)說明書要求，使用螢光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?。實驗結(jié)果以螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraghPad Prism 5擬合細(xì)胞存活曲線。采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞活力的影響

用不同濃度的白頭翁皂苷A處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的活力抑制率隨著白頭翁皂苷A的濃度升高而顯著升高（P＜0.05），見表1。白頭翁皂苷A的濃度為10 mg/L時，細(xì)胞活力抑制率為50%左右，因此我們將10 mg/L作為后續(xù)實驗用藥濃度。

2 白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞放療敏感性的影響

集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，在MCF-7細(xì)胞中對照組和白頭翁皂苷A組的D0值分別是2.846和1.517，白頭翁皂苷A的SER是1.876，見表2。細(xì)胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，白頭翁皂苷A聯(lián)合照射組的SF小于單純照射對照組，存活曲線下移（P＜0.05），見圖1。

表1 不同濃度的白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞活力的影響Table 1.Effect of different concentrations of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

表2 對照組和白頭翁皂苷A組的多靶單擊模型參數(shù)Table 2.The parameters of multitarget single-hit model in control and Pulsatilla saponin A groups.

Figure 1.Survival curve of MCF-7 cells after different doses of irradiation.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group.圖1 不同劑量照射后MCF-7細(xì)胞的存活曲線

3 白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p和RNF2表達(dá)的影響

相較于對照組，白頭翁皂苷A組中miR-24-3p的表達(dá)水平顯著升高，RNF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

4 miR-24-3p靶向調(diào)控RNF2的表達(dá)

Figure 2.RNF2 protein electropherogram of control and Pulsatilla saponin A groups.圖2 對照組和白頭翁皂苷A組的RNF2蛋白電泳圖

表3 白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p和RNF2表達(dá)的影響Table 3.Effect of Pulsatilla saponin A on expression of miR-24-3p and RNF2 in MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到RNF2與miR-24-3p存在結(jié)合位點，見圖3A。螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-RNF2的MCF-7細(xì)胞中，miR-24-3p組的螢光素酶活性較于miR-NC組顯著降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染MUT-RNF2的細(xì)胞中，兩組的螢光素酶活性無顯著差異，見表4。相較于miR-NC組，miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中RNF2蛋白的表達(dá)顯著降低；而相較于anti-miR-NC組，anti-miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中RNF2蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖3B及表5。*P＜0.05vsmiR-NCgroup.*P＜0.05vsmiR-NCgroup；#P＜0.05vsanti-miR-NCgroup.

Figure 3.miR-24-3p targeted RNF2 and regulated its expression.A：the 3′UTRof RNF2 contains a nucleotide sequence complementary to miR-24-3p；B：RNF2 protein electropherogram.圖3 miR-24-3p靶向調(diào)控RNF2的表達(dá)

表4 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果Table 4.The results of dual-luciferase reporter assay（Mean±SD.n=9）

表5 miR-24-3p調(diào)控RNF2蛋白的表達(dá)Table 5.miR-24-3p regulated the expression of RNF2 protein（Mean±SD.n=9）

5 miR-24-3p過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖和放療敏感性的影響

相較于miR-NC組，miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且細(xì)胞活力的抑制率顯著升高（P＜0.05），見表6。集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，miR-NC組和miR-24-3p組的D0值分別是2.267和1.370，miR-24-3p過表達(dá)的SER是1.655，見表7。細(xì)胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，miR-24-3p組的SF顯著小于miR-NC組，存活曲線顯著下移（P＜0.05），見圖4。

表7 miR-NC組和miR-24-3p組的多靶單擊模型參數(shù)Table 7.The parameters of multitarget single-hit model in miRNCand miR-24-3p groups

6 抑制miR-24-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞增殖和放療敏感性的作用

相較于白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組，白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），RNF2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且細(xì)胞活力的抑制率顯著降低（P＜0.05），見圖5及表8。

Figure 4.Effect of miR-24-3p overexpression on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group.圖4 miR-24-3p過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響

Figure 5.RNF2 protein electropherogramof different groups.圖5 各組RNF2蛋白電泳圖

表8 抑制miR-24-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞活力的作用Table 8.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，白頭翁皂苷A組和白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SER分別是1.766和0.603，見表9。細(xì)胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SF大于白頭翁皂苷A+antimiR-NC組，存活曲線上移（P＜0.05），見圖6。

討 論

近年來研究表明，中醫(yī)藥可以減輕放化療帶來的毒副反應(yīng)，且可提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性［9］。中藥白頭翁中提取的有效成分皂苷具有體外抗腫瘤作用［10］，如白頭翁皂苷A可以通過調(diào)控Bcl-2、cyclin B1等蛋白的表達(dá)促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡［11］。在急性白血病中，白頭翁皂苷A可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化；還可誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞系（K562、U937及HL-60細(xì)胞）及其原代細(xì)胞向更成熟的粒系分化［12］。白頭翁皂苷A可增強(qiáng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性［5］。白頭翁皂苷D通過抑制AKT/mTOR信號通路可抑制結(jié)腸癌腫瘤的血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］；而抑制PI3K通過降低AKT活性可提高M(jìn)CF-7細(xì)胞對放射的敏感性［14］。以上結(jié)果表明，白頭翁皂苷不僅具有抗腫瘤作用，還能增加癌細(xì)胞對輻射的敏感性。本實驗結(jié)果顯示，白頭翁皂苷A可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，且增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。與先前研究報道相符。

表9 各組多靶單擊模型參數(shù)Table 9.The parameters of multitarget single-hit model in different groups

Figure 6.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Pulsatilla saponin A+anti-miR-NCgroup.圖6 抑制miR-24-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白頭翁皂苷A對MCF-7細(xì)胞放射敏感性的作用

miRNA不僅參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，還與細(xì)胞放射敏感性相關(guān)。miR-24-3p在膀胱癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［15-16］。miR-24-3p通過靶向SOX7促進(jìn)肺癌中的細(xì)胞遷移和增殖［17］。miR-24-3p通過靶向下調(diào)PRKCH可抑制腺樣囊性癌細(xì)胞的活力、增殖、遷移、侵襲等［18］。過表達(dá)miR-24通過靶向SP1能增強(qiáng)鼻咽癌的放射敏感性［19］。既往研究表明miR-24-3p在MCF-7細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，進(jìn)而影響乳腺癌預(yù)后［7］。本研究表明，過表達(dá)miR-24-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，與前人研究相符，且過表達(dá)miR-24-3p增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。

miRNA可通過調(diào)控其靶基因發(fā)揮多種生物學(xué)作用［20-21］。研究顯示，RNF2在乳腺癌組織中高表達(dá)，是一種癌基因［22］。沉默RNF2可能通過上調(diào)Bax以及下調(diào)cyclin D2、cyclin依賴性激酶4和Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性［23］；下調(diào)RNF2還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，增強(qiáng)U87細(xì)胞對放射的敏感性［24］。本研究表明，miR-24-3p靶向下調(diào)RNF2的表達(dá)，且白頭翁皂苷A促進(jìn)miR-24-3p的表達(dá)，抑制RNF2的表達(dá)。這提示白頭翁皂苷A可能通過調(diào)控miR-24-3p/RNF2影響乳腺癌細(xì)胞的增殖及放射敏感性。

綜上所述，白頭翁皂苷A在體外具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其放射敏感性的作用。這些作用可能是通過上調(diào)miR-24-3p、下調(diào)RNF2的表達(dá)實現(xiàn)的。