mmLDL通過p38 MAPK通路上調(diào)小鼠腸系膜動脈ET受體*

謝 希， 陳 琛， 林 杰， 湯宏霞， 秦旭平， 李 潔△

（1南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院，郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000；2南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽421001）

弱氧化修飾低密度脂蛋白（minimally modified low-density lipoprotein，mmLDL）是指載脂蛋白B結(jié)構(gòu)完整、氧化程度輕微的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL），它可以促進單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附；促進血管平滑肌細胞遷移和增殖；促進氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）形成，從而促進泡沫細胞的產(chǎn)生［1-3］；可以損傷內(nèi)皮細胞導(dǎo)致免疫細胞浸潤到血管壁，隨后發(fā)生脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)［4］，產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和炎性細胞因子。這一系列反應(yīng)促進動脈粥樣硬化的形成。

p38 MAPK是動脈粥樣硬化過程中一種常見的炎癥通路［5］，參與炎癥信號傳導(dǎo)，調(diào)控細胞黏附分子，調(diào)節(jié)白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［6］，增強血管對血管內(nèi)皮生長因子和ROS的敏感性，激活NF-κB通路，NF-κB是MAPK通路下游一個核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有明顯的增殖、抗凋亡和促炎作用，NF-κB途徑的激活在炎癥過程中起重要作用［7-8］。在IL-6家族中，IL-6是主要的促炎細胞因子，IL-6信號通路包括糖蛋白130/膜結(jié)合IL-6受體通路和糖蛋白130/可溶性IL-6受體通路，分別稱為經(jīng)典信號和反式信號［9］。有研究表明，細胞內(nèi)MAPK信號通路在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮素受體表達中起重要作用［10］。

內(nèi)皮素（endothelin，ET）系統(tǒng)是由受體及其配體組成，是調(diào)節(jié)血管張力和血壓的重要部分，在心血管發(fā)病機制中的發(fā)揮重要作用。受體調(diào)節(jié)是通過改變受體密度和（或）親和力及靶細胞敏感性來維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個重要因素［11］。ET-1是體內(nèi)最強的血管收縮劑之一，并且引起的收縮作用持久。內(nèi)皮素受體分為A型（ETA受體）和B型（ETB受體）兩種亞型。ETA受體在血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）上表達，主要調(diào)節(jié)血管收縮和細胞增殖［12］，并與MAPK通路的激活有關(guān)［10］。ETB受體分為ETB1和ETB2兩類：ETB1受體位于內(nèi)皮細胞，通過誘導(dǎo)前列環(huán)素I2（prostacyclin I2，PGI2）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的釋放起血管舒張作用；ETB2受體表達于VSMCs并介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)。在正常生理條件下，ETB2受體基本不表達，不引起收縮效應(yīng)［13］，而在病理條件下，如缺血性心臟?。?4］、肺動脈高壓［15］和動脈粥樣硬化患者［12，16-17］，血管平滑肌 ETB2受體表達明顯增加，并且介導(dǎo)血管收縮作用明顯增強。一般情況下我們說的ETB受體指的是ETB2受體。未見文獻報道m(xù)mLDL對在體動物動脈ETA受體的作用，但我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠尾靜脈注射mmLDL可以上調(diào)腸系膜動脈 ETB受體［1，3］。本研究首次考察小鼠尾靜脈注射mmLDL是否通過激活p38 MAPK通路上調(diào)腸系膜動脈VSMCs中的ETA受體和ETB受體，以及mmLDL對IL-6的影響。

材料與方法

1 mmLDL的制備

4℃條件下，將0.2 g/L的LDL置于加入了1 μmol/L FeSO4的PBS液體中氧化96 h，最后使用0.25 mmol/L EDTA終止該反應(yīng)即可生成mmLDL［1，18］。將mmLDL產(chǎn)物使用硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）法和瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定。TBARS法檢測結(jié)果顯示，丙二醛樣結(jié)構(gòu)的濃度為（10.95±0.08）μmol/（g LDL）；0.8%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，mmLDL的電泳遷移率是LDL的（1.67±0.01）倍。制備好的mmLDL于4℃冰箱避光保存，2周內(nèi)用完。

2 主要試劑

LDL、ETB受體激動劑角蝰毒素6c（sarafotoxin 6c，S6c）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和BQ-788購于Sigma；抗ETA受體抗體、抗ETB受體抗體、抗p38 MAPK抗體、抗NF-κB p65抗體、抗p-NF-κBp65抗體、辣根過氧化物酶標記的GAPDH單克隆抗體、抗IL-6抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購于Pierce Biotechnology；ET-1購于Enzo；抗p-p38 MAPK抗體購于Cell Signaling Technology；Tween 20和IL-6 ELISA試劑盒購于Proteintech Biotechnology；小鼠oxLDL ELISA試劑盒購于北京誠林生物科技有限公司；SB 203580購于Med-Chem Express，需用DMSO初溶。

3 主要儀器

DMT 620微血管張力測定儀（Danish Myo Technology A/S）；SZ51立體顯微鏡（OLYMPUS）；顯微手術(shù)解剖工具（World Precision Instruments）；優(yōu)普純水機（成都優(yōu)普純水設(shè)備有限公司）；電泳/蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（大連競邁生物科技有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；WX3000P實時熒光定量PCR儀（Stratagene）；Image Gauge 4.0（Fuji Photo Film）。

4 實驗動物及分組

8～12周齡的SPF級昆明小鼠共140只，體重25～30 g，雌雄均可，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（湘）2016-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實驗研究。

動物隨機分為正常對照（生理鹽水，normal saline，NS）組（尾靜脈注射NS）、mmLDL組（尾靜脈注射 mmLDL）、mmLDL+SB 203580組（尾靜脈注射mmLDL及腹腔注射p38 MAPK通路抑制劑SB 203580）、LDL組（尾靜脈注射 LDL）和 mmLDL+DMSO組（尾靜脈注射mmLDL及腹腔注射DMSO）。NS組、mmLDL組和mmLDL+SB 203580組每組各40只；LDL組和mmLDL+DMSO組每組各10只。mmLDL 按照 1 mg/kg［3，19］的劑量連續(xù) 4 d 進行尾靜脈注射，共8次，每隔12 h一次，于96 h采用眼球取血法采血后將小鼠頸椎脫臼處死。以相同方式給小鼠尾靜脈注射NS作為正常對照組。為考察p38 MAPK炎癥通路是否參與mmLDL對小鼠腸系膜動脈ET受體表達的影響，在每日第一次小鼠尾靜脈注射mmLDL的前2 h，腹腔注射p38 MAPK抑制劑SB 203580溶液，劑量為25 mg/kg［20-21］，每隔24 h一次；另設(shè)置溶劑對照組（mmLDL+DMSO組）。

5 主要方法

5.1 血管收縮功能檢測 小鼠處死后，即刻取出其腸系膜動脈組織并浸入預(yù)冷至4℃的Na+-Krebs溶液（成分：無水CaCl21.5 mmol/L，NaCl 119 mmol/L，葡萄糖 5.5 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L）。在立體顯微鏡下將所需動脈周圍組織快速剝離干凈，為了去除血管內(nèi)皮影響，使用0.1%的TritonX-100液灌注血管10 s，隨后用Na+-Krebs溶液反復(fù)沖洗血管多次，再用20μmol/L 5-羥色胺刺激血管預(yù)收縮；最后加入10μmol/L乙酰膽堿進行檢驗，若所引起的舒張率＜10%，則表明血管內(nèi)皮去除完全。用顯微手術(shù)剪將去內(nèi)皮的腸系膜動脈剪成1.5～2 mm的血管環(huán)，每個血管環(huán)中穿入兩根半徑為20μm金屬絲，浸入37℃DMT恒溫浴槽中，金屬絲兩端分別與張力微調(diào)裝置和換能器相連接。張力換能器與電腦PowerLab系統(tǒng)相連，記錄血管張力變化。通過微調(diào)裝置將血管環(huán)靜息張力調(diào)整在1.5 mN左右，每隔15 min更換一次Na+-Krebs溶液，如此平衡1.5 h后2次使用K+-Krebs液（成分：KCl 63.5 mmol/L，無水CaCl21.5 mmol/L，NaCl 60 mmol/L，葡 萄 糖 5.5 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L）檢查血管環(huán)活性，當(dāng)2次測得K+-Krebs溶液所引起的血管環(huán)收縮張力均大于1 mN，并且兩次收縮幅度差＜10%即說明血管環(huán)合格，可繼續(xù)后續(xù)實驗。在浴槽中加入相應(yīng)的試劑：S6c可以特異性激動ETB受體，引起ETB受體介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)；現(xiàn)無ETA特異性激動劑，研究ETA受體介導(dǎo)的收縮時，先將1μmol/L的S6c誘導(dǎo)ETB受體產(chǎn)生最大收縮，保持S6c與浴槽內(nèi)血管環(huán)接觸1 h，收縮曲線逐漸下降，至基線水平，并保持穩(wěn)定，即認為ETB受體完全脫敏［22-23］，此時加入ET-1，將只激動 ETA受體。為了檢查ETB受體是否完全脫敏，在使用S6c后，加入選擇性ETB受體拮抗劑BQ-788（0.1μmol/L），再加入ET-1介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)，結(jié)果顯示加入或不加入BQ-788，ET-1介導(dǎo)的血管收縮量效曲線幾乎重疊，說明ETB受體完全脫敏［22-23］。

5.2 ELISA檢測小鼠血清中oxLDL和IL-6的表達小鼠眼球取血后，室溫自然凝固25 min，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，于-80℃保存，如保存過程中出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。oxLDL和IL-6血清濃度采用小鼠ELISA試劑盒測定。嚴格按廠家說明書進行操作，于酶標儀上讀取吸光度，繪制標準曲線，根據(jù)相應(yīng)標準曲線計算樣品中oxLDL和IL-6含量。

5.3 RT-qPCR檢測小鼠腸系膜動脈組織的mRNA含量 提取腸系膜動脈組織的總mRNA并檢測其密度。兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA第1條鏈的合成采用20μL反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)錄程序為：25℃10 min，42℃ 60 min，65℃ 15 min。50μL qPCR體系的反應(yīng)程序為：95℃ 5 min變性；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用分離曲線分析法以確定PCR產(chǎn)物的特異性。mRNA定量分析采用PCR循環(huán)閾值（CT）比較法，以GAPDH為內(nèi)參照，計算ETA受體、ETB受體和IL-6的mRNA相對表達量。特異性引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

5.4 Western bolt法檢測小鼠腸系膜動脈組織中的目的蛋白含量 每個樣本由3根腸系膜動脈組成，取研磨篩至冰上，將預(yù)處理好的血管環(huán)段加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑，于研磨篩上充分研磨后12 000 r/min離心30 min，仔細收集上清液，使用BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量。加入1/4蛋白液體積的buffer（5×），100℃水浴10 min使蛋白變性；提取的蛋白用SDS-PAGE進行分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，分別將I抗（抗ETA受體、ETB受體、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κBp65、IL-6和GAPDH抗體）均按1∶1 000稀釋，4℃過夜，II抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（1∶5 000稀釋）。圖像經(jīng)Image Gauge 4.0分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的基因的條帶灰度與管家基因的灰度比值表示蛋白的表達水平。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，血管環(huán)收縮曲線均通過累加激動劑獲得，其收縮值以相對63.5 mmol/L K+預(yù)收縮的百分比表示。用Emax（最大收縮百分率）和pEC50（血管達最大收縮效應(yīng)的50%時相應(yīng)激動劑摩爾濃度的負對數(shù)）來描述血管收縮功能。采用Pearson線性相關(guān)分析評估IL-6血清水平與ETB受體和ETA受體介導(dǎo)的血管最大收縮功能之間的聯(lián)系。Student'st檢驗用于兩組數(shù)據(jù)之間的比較；單因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett事后檢驗比較兩組以上數(shù)據(jù)；雙因素方差分析和Bonferroni事后檢驗用于比較2條曲線在相同濃度處產(chǎn)生的收縮值之間的差異。統(tǒng)計分析及作圖使用Prism 5.0軟件。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動脈內(nèi)皮去除的驗證及血管環(huán)對K+的收縮反應(yīng)

經(jīng)Triton X-100處理過的血管環(huán)由乙酰膽堿引起的舒張率＜5%，表明實驗血管內(nèi)皮去除完全。mmLDL組、mmLDL+SB 203580組、mmLDL+DMSO組、NS組和LDL組實驗血管環(huán)在K+-Krebs液刺激下均明顯收縮，各組收縮張力分別為（4.33±0.38）mN、（4.00±0.28） mN、（4.01±0.27） mN、（4.41±0.34）mN和（4.14±0.31）mN（P＞0.05）。

2 小鼠血清oxLDL水平

ELISA結(jié)果顯示，mmLDL組和NS組血清中oxLDL 的 濃 度 分 別 為（116.95±2.853）μg/L 和（117.52±3.788）μg/L（P＞0.05），排除oxLDL對實驗結(jié)果的影響，見圖1。

Figure 1.Serumlevels of oxLDL.Mean±SEM.n=8.圖1 mmLDL組和NS組小鼠血清oxLDL濃度

3 SB 203580抑制mmLDL對小鼠腸系膜動脈ETB受體功能及表達的增強作用

DMT實驗結(jié)果顯示，mmLDL組S6c誘導(dǎo)ETB受體介導(dǎo)的收縮功能呈濃度依賴性增強，血管收縮量效曲線明顯左移，Emax由NS組的（5.85±1.04）%升高為mmLDL組的（127.51±9.99）%（P＜0.01），而pEC50（8.11±0.24和8.00±0.04）無顯著差異（P＞0.05）；腹腔注射SB 203580后，S6c誘導(dǎo)的收縮血管的量效曲線右移明顯，Emax［（37.42±4.96）%］較mmLDL組明顯降低（P＜0.01），pEC50（7.86±0.06）有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A。

RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，mmLDL組ETB受體的mRNA水平較NS組的1.01±0.05上升為2.19±0.10（P＜0.01）；使用SB 203580后，ETB受體的mRNA水平降為1.29±0.08（P＜0.01），見圖 2B。Western bolt實驗結(jié)果顯示，mmLDL組ETB受體的蛋白水平從0.35±0.02 上升為 1.01±0.02（P＜0.01）；腹腔注射SB 203580后，ETB受體的蛋白水平降為0.55±0.01（P＜0.01），見圖2C。

Figure 2.The p38 MAPK inhibitor SB 203580 inhibited mmLDL-induced increases in ETB receptor function and expression in mouse mesenteric artery.A：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced blood vessel contraction mediated by ETB receptor（n=8）；B：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of ETB receptor mRNA expression（n=6）；C：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of ETB receptor protein expression（n=4）.Conc.：concentraion；M：mol/L.Mean±SEM.**P＜0.01 vs NSgroup；##P＜0.01 vs mmLDL group.圖2 p38 MAPK抑制劑SB 203580拮抗mmLDL對小鼠腸系膜動脈ETB受體功能及表達的增強作用

4 SB 203580抑制mmLDL對小鼠腸系膜動脈ETA受體功能及表達的增強作用

DMT實驗結(jié)果顯示，mmLDL組ET-1誘導(dǎo)ETA受體介導(dǎo)的收縮功能呈濃度依賴性增強，血管收縮量效曲線明顯左移，Emax由NS組的（145.12±9.55）%升高為mmLDL組的（232.31±22.79）%（P＜0.01），而pEC50（8.29±0.07 和 8.20±0.02）無 顯 著差 異（P＞0.05）；腹 腔 注射 SB 203580后，Emax［（160.34±8.30）%］較 mmLDL組明顯降低（P＜0.01），pEC50（8.20±0.06）無明顯變化（P＞0.05），見圖3A。

RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，mmLDL組ETA受體的mRNA水平由NS組的1.01±0.07上升為2.91±0.16（P＜0.01）；使用SB 203580后，ETA受體的mRNA水平降為1.55±0.05（P＜0.01），見圖3B。Western bolt實驗結(jié)果顯示，mmLDL組ETA受體的蛋白水平由NS組的0.24±0.04上升為0.94±0.03（P＜0.01）；腹腔注射SB 203580后，ETA受體的蛋白水平降為0.54±0.04（P＜0.01），見圖3C。

5 SB 203580抑制mmLDL引起的小鼠血清及腸系膜動脈IL-6水平升高

ELISA實驗結(jié)果顯示，mmLDL組血清的IL-6濃度從 NS組的（238.9±12.44）ng/L上升至（433.6±10.96）ng/L（P＜0.01）；使用SB 203580后，IL-6的血清濃度降為（330.2±12.15）ng/L（P＜0.01），見圖4A。

RT-PCR實驗結(jié)果顯示，mmLDL組IL-6的mRNA水平從 NS組的 1.02±0.08上升至 4.11±0.35（P＜0.01）；使用SB 203580后，IL-6的mRNA水平降為1.97±0.17（P＜0.01），見圖4B。Western blot實驗結(jié)果顯示，尾靜脈注射mmLDL后IL-6的蛋白水平從NS組的 0.29±0.04上升至 0.97±0.08（P＜0.01）；使用SB 203580后，IL-6蛋白水平降為 0.48±0.03（P＜0.01），見圖4C。

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-6的血清濃度與ETB受體和ETA受體介導(dǎo)的血管收縮Emax值之間均存在正相關(guān)（r=0.87，P＜0.05；r=0.97，P＜0.01），見圖4D、E。

Figure 3.The p38 MAPK inhibitor SB 203580 inhibited mmLDL-induced increases in ETA receptor function and expression in mouse mesenteric artery.A：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced blood vessel contraction mediated by ETA receptor（n=8）；B：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of ETA receptor mRNA expression（n=6）；C：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of ETA receptor protein expression（n=4）.Conc.：concentraion；M：mol/L.Mean±SEM.**P＜0.01 vs NSgroup；##P＜0.01 vs mmLDL group.圖3 p38 MAPK抑制劑SB 203580拮抗mmLDL引起的小鼠腸系膜動脈ETA受體功能及表達增強

6 SB 203580對mmLDL誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動脈中p-p38 MAPK和p-NF-κB蛋白水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，mmLDL組p-p38 MAPK和p-NF-κB的蛋白水平分別由NS組的0.12±0.02和 0.16±0.03上升為 0.57±0.06和 1.02±0.03（P＜0.01）；使用SB 203580后，p-p38 MAPK和p-NF-κB 的蛋白水平分別降為 0.32±0.04和 0.50±0.05（P＜0.01），見圖5。

討 論

mmLDL作為重要的心血管疾病危險因子，在動脈粥樣硬化初期起重要的作用，但其具體機制尚不明確。本課題組在體外研究中采用器官培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)mmLDL與大鼠冠狀動脈共同培養(yǎng)，可以上調(diào)ETA受體和ETB受體［22，24］，mmLDL 與大鼠腦基底動脈共同培養(yǎng)，可以上調(diào)ETB受體［25］；小鼠在體實驗發(fā)現(xiàn)mmLDL可以通過ERK1/2途徑，增加TNF-α和IL-1β水平，增加小鼠腸系膜ETB受體和α1受體介導(dǎo)的血管收縮功能及表達［2-3］；小鼠在體實驗發(fā)現(xiàn)mmLDL可以通過PI3K/Akt途徑，增加小鼠腸系膜ETB受體介導(dǎo)的血管收縮功能及表達［1］。本研究通過小鼠在體實驗研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK炎癥通路參與mmLDL誘導(dǎo)上調(diào)小鼠腸系膜動脈ETA受體和ETB受體，增加炎癥因子IL-6血清濃度及血管壁的表達。

VSMCs內(nèi)ETA受體和ETB受體的表達異常與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ETA受體和ETB受體的上調(diào)可致血管收縮增強并減少血液流動，促進VSMCs的增殖和遷移，參與動脈粥樣硬化過程并導(dǎo)致心血管相關(guān)疾?。?3，26-28］。有研究表明，大鼠暴露于二手煙環(huán)境中，可激活ERK1/2途徑，誘導(dǎo)增加腦基底動脈和冠狀動脈ETA受體和ETB受體介導(dǎo)的血管收縮功能及表達［17，29］，從而增加缺血性腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化等疾病的風(fēng)險。還有報道指出，通過體外器官培養(yǎng)，PM2.5可以增強大鼠支氣管ET受體介導(dǎo)的收縮功能及表達，MEK1/2和p38通路參與ETB受體上調(diào)，JNK和p38通路參與ETA受體的上調(diào)，從而增加肺動脈高壓等疾病風(fēng)險［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，通過小鼠尾靜脈注射mmLDL，可以增強ETA受體和ETB受體介導(dǎo)的血管收縮功能，提高腸系膜動脈ETA受體和ETB受體的mRNA和蛋白表達。實驗結(jié)果顯示，mmLDL+DMSO組和mmLDL組血管收縮的量效曲線幾乎重疊，排除了DMSO對本實驗結(jié)果的影響；LDL組血管收縮的量效曲線雖略高于NS組，但兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，排除了LDL對本實驗結(jié)果的影響；使用K+-Krebs液考察血管的收縮功能，K+-Krebs液在mmLDL組、mmLDL+SB 203580組、mmLDL+DMSO組和NS組引起的血管收縮反應(yīng)均大于1 mN，且各組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，排除了實驗操作對血管收縮功能的影響。我們同時也檢測血壓，發(fā)現(xiàn)此時血壓不受影響。

Figure 4.The p38 MAPK inhibitor SB 203580 inhibited mmLDL-induced increases in mouse serum and mesenteric artery IL-6 levels.A：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced increase in serum IL-6 level（n=8）；B：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of IL-6 mRNA expression（n=6）；C：inhibitory effect of SB 203580 on mmLDL-induced up-regulation of IL-6 protein expression（n=4）；D：the positive linear correlation between the serum IL-6 level and the maximum S6c-induced contraction responses（n=8）；E：the positive linear correlation between the serum IL-6 level and the maximum ET-1-induced contraction responses（n=8）.Mean±SEM.**P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs mmLDL group.圖4 p38 MAPK抑制劑SB 203580拮抗mmLDL誘導(dǎo)的小鼠血清及腸系膜動脈IL-6水平升高

Figure 5.The p38 MAPK inhibitor SB 203580 inhibited mmLDL-induced increases in p-p38 MAPK（A）and p-NF-κB（B）protein levels in mouse mesenteric artery.Mean±SEM.n=4.**P＜0.01 vs NSgroup；##P＜0.01 vs mmLDL group.圖5 p38 MAPK抑制劑SB 203580拮抗mmLDL上調(diào)的小鼠腸系膜動脈中p-p38 MAPK和p-NF-κB的蛋白水平

SB 203580是p38 MAPK選擇性抑制劑［14］。有研究表明，SB 203580可以預(yù)防I型糖尿病動物模型中的糖尿病心肌病，通過抑制p38 MAPK途徑降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，減輕心肌炎癥反應(yīng)，改善心臟功能［7］；SB 203580可以預(yù)防肺動脈高壓的發(fā)展，通過抑制p38 MAPK途徑降低關(guān)鍵炎癥介質(zhì)IL-6水平，逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)［5］。早期本課題組發(fā)現(xiàn)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了mmLDL誘導(dǎo)上調(diào)離體VSMCs ETB受體［24］。本研究通過給小鼠腹腔注射p38 MAPK通路選擇性抑制劑SB 203580，抑制了mmLDL增加p-p38 MAPK和p-NF-κB蛋白水平，表現(xiàn)為p-p38 MAPK以及p-NF-κB蛋白條帶灰度值較mmLDL組明顯減弱；表明尾靜脈注射mmLDL激活了p38 MAPK通路及下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。

細胞炎癥因子IL-6參與慢性炎癥疾病病理生理過程，如肺動脈高壓［5］、糖尿病［31］、動脈粥樣硬化［32］。IL-6可分泌于白細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞被感染的情況下，并可以被IL-1β或TNF-α等細胞因子誘導(dǎo)［9］。IL-6調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸，參與單核細胞趨化、血管生成和膠原積累，影響細胞增殖、分化、遷移和存活［33］，加速動脈粥樣硬化進程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射mmLDL明顯增加IL-6的mRNA水平、蛋白水平和血清濃度。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清IL-6水平升高與ETA受體和ETB受體介導(dǎo)的最大收縮百分率呈正相關(guān)，表明尾靜脈注射mmLDL可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)可能參與了mmLDL上調(diào)ETA受體和ETB受體的過程。而SB 203580顯著抑制了此作用，表明p38 MAPK通路參與mmLDL上調(diào)ETA受體、ETB受體和IL-6表達的過程。

綜上所述，mmLDL激活p38 MAPK信號通路及下游的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，可以增加腸系膜動脈ETA受體和ETB受體表達，增強ETA受體和ETB受體介導(dǎo)的血管收縮功能，增加IL-6血清濃度及血管壁表達，并且血清IL-6水平升高與ETA受體和ETB受體介導(dǎo)的最大收縮百分率呈正相關(guān)。了解這一點，可為心血管疾病診斷及治療提供新的靶點。