禁錮應(yīng)激對小鼠焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響

孫曉敏 張萌 遲宜嘉 郭林靄 石海群 周宇

[摘要] 目的 研究反復(fù)禁錮應(yīng)激對小鼠焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響。方法 將2月齡雄性C57BL6/J小鼠12只隨機(jī)均分為對照組、禁錮后90 min組和禁錮后7 d組，對后兩組小鼠進(jìn)行反復(fù)禁錮應(yīng)激。利用高架十字迷宮實驗檢測3組小鼠的焦慮水平，采用免疫熒光技術(shù)檢測3組小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）、下丘腦（HY）、腹側(cè)海馬（vHPC）、基底外側(cè)杏仁核（BLA）等4個焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況。結(jié)果 高架十字迷宮實驗表明，反復(fù)禁錮應(yīng)激后7 d，小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為（t=3.364、6.386，P<0.05），而禁錮應(yīng)激后90 min的小鼠焦慮樣行為不明顯（P>0.05）。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，禁錮后90 min組小鼠各腦區(qū)c-Fos表達(dá)均明顯增加（F=13.4～645.0，q=5.1～31.6，P<0.01），而禁錮后7 d組小鼠只有HY和BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)仍然明顯增加（q=3.0、3.0，P<0.05）。結(jié)論 反復(fù)禁錮應(yīng)激導(dǎo)致HY和BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)持續(xù)增加，這可能與小鼠的焦慮樣行為密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 焦慮;約束，身體的;大腦;基因，即早;小鼠

[中圖分類號] R338.2 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0177-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.067 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1001.018.html;2020-04-17 17：12

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of repeated restraint stress on the expression of c-Fos in anxiety-related brain regions in mice. ?Methods A total of 12 male C57BL6/J mice， aged 2 months， were randomly divided into control group， 90 min post-stress group， and 7 d post-stress group， and the mice in the latter two groups were given repeated restraint stress. The elevated plus maze test was used to evaluate the level of anxiety， and immunofluorescence assay was used to measure the expression of c-Fos in the four anxiety-related brain regions of the medial prefrontal cortex （mPFC）， the hypothalamus （HY）， the ventral hippocampus （vHPC）， and the basolateral amygdala （BLA）. ?Results The elevated plus maze test showed that the mice displayed significant anxiety-like behavior on day 7 after repeated restraint stress （t=3.364，6.386，P<0.05）， while the mice in the 90 min post-stress group did not develop significant anxiety-like behavior （P>0.05）. The results of immunofluorescence assay showed that compared with the control group， the 90 min post-stress group had a significant increase in the expression of c-Fos in each brain region （F=13.4-645.0，q=5.1-31.6，P<0.01）， while the 7 d post-stress group had a significant increase in the expression of c-Fos in the HY and the BLA （q=3.0，3.0，P<0.05）. ?Conclusion Repeated restraint stress leads to a continuous increase in c-Fos expression in the HY and the BLA， which may closely associated with anxiety-like behavior in mice.

[KEY WORDS] anxiety; restraint， physical; cerebrum; genes， immediate-early; mice

適度的焦慮對動物與人類的生存具有重要意義，但過度的焦慮則是一種情緒障礙。焦慮癥等情感障礙性精神疾病的病因至今仍不清楚，但普遍的觀點認(rèn)為遺傳和環(huán)境等因素相互作用在焦慮抑郁等情感障礙性精神疾病的發(fā)病中占有至關(guān)重要的地位。應(yīng)激刺激是導(dǎo)致焦慮的重要誘發(fā)因素。研究表明，內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）、腹側(cè)海馬（vHPC）、基底外側(cè)杏仁核（BLA）、下丘腦（HY）等腦區(qū)在焦慮相關(guān)行為調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，是重要的焦慮神經(jīng)環(huán)路節(jié)點[1-4]。在應(yīng)激導(dǎo)致焦慮的研究中，反復(fù)禁錮應(yīng)激常被用于急性和慢性焦慮造模，能顯著引起小鼠的焦慮樣行為[5-11]。本實驗室前期研究結(jié)果顯示，在4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激后的7～12 d，小鼠的焦慮樣行為表型明顯。神經(jīng)元受到外界刺激后會迅速表達(dá)c-Fos，c-Fos蛋白的表達(dá)通常被認(rèn)為是神經(jīng)元活動的重要標(biāo)志[12]。張頎等[13]以c-fos為探針研究顯示，強(qiáng)迫游泳后C57BL/6小鼠的mPFC、杏仁核、伏隔核被激活。既往研究觀察的多是應(yīng)激后c-Fos的急性表達(dá)，而對于焦慮狀態(tài)下c-Fos在不同腦區(qū)的表達(dá)鮮有報道。因此，本研究擬觀察4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激后90 min及7 d時小鼠mPFC、HY、vHPC、BLA腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況，旨在探討反復(fù)禁錮應(yīng)激對小鼠焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響，以及c-Fos表達(dá)與焦慮樣行為之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

實驗動物為2月齡雄性C57BL6/J小鼠12只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)條件為溫度（21±2）℃、濕度（50±10）%、12 h/12 h晝夜等長循環(huán)光照，小鼠可自由飲水、進(jìn)食。小鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境至少1周后進(jìn)行實驗。c-Fos一抗為c-Fos（9F6）Rabbit mAb#2250，購自美國Cell Signaling Technology公司;c-Fos二抗為Alexa-568 goat anti-rabbit，購自美國Invitrogen公司。

1.2 動物分組及處理

實驗前將小鼠隨機(jī)分為對照組（A組）、禁錮后90 min組（B組）和禁錮后7 d組（C組），每組4只。對3組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)測試，檢測其基礎(chǔ)焦慮水平。B組和C組小鼠進(jìn)行連續(xù)4 d的反復(fù)禁錮應(yīng)激，分別于4 d禁錮后90 min和禁錮后7 d再次進(jìn)行高架十字迷宮測試，然后立即進(jìn)行灌注取腦。A組小鼠不做任何處理，直接從飼養(yǎng)籠中取出進(jìn)行灌注取腦。整個實驗過程中3組小鼠均正常飼養(yǎng)，沒有出現(xiàn)小鼠缺失的情況。

1.3 反復(fù)禁錮應(yīng)激

將小鼠用異氟烷輕度麻醉后放置于禁錮器中1 h，禁錮時間為每天下午14：00—15：00，連續(xù)禁錮4 d。禁錮器是兩端均可拆開的圓筒狀物，材質(zhì)為有機(jī)玻璃，透明且通風(fēng)透氣良好。被放于禁錮器中的小鼠無法移動，不可掉頭。

1.4 高架十字迷宮實驗

實驗裝置由十字迷宮、視頻采集系統(tǒng)及分析系統(tǒng)3部分組成。高架十字迷宮是由兩個開放臂、兩個閉合臂及一個中心區(qū)組成。測試時，將小鼠從中心區(qū)釋放入迷宮，讓小鼠在高架十字迷宮中自由活動10 min。通過Noduls自動分析系統(tǒng)記錄小鼠在開放臂、閉合臂、中心區(qū)各個區(qū)域的探索時間以及進(jìn)出開放臂和閉合臂的次數(shù)。

1.5 c-Fos免疫熒光染色和免疫陽性細(xì)胞計數(shù)

用生理鹽水和新配制的40 g/L多聚甲醛對小鼠進(jìn)行心臟灌注，取腦放入4 ℃多聚甲醛中固定6 h，然后轉(zhuǎn)入300 g/L蔗糖溶液中至沉淀。用恒冷箱冷凍切片機(jī)切片（厚度40 μm），放入 0.01 mol/L的PBS溶液中。小鼠的腦切片用體積分?jǐn)?shù)0.04的山羊血清封閉液封閉1 h，加c-Fos一抗（1∶3 200）在4 ℃搖床中孵育 72 h，孵育后以PBS溶液沖洗3次，每次10 min。然后加熒光二抗（1∶500）孵育2 h，以PBS清洗3次，每次15 min。洗完后用封片劑ProLong Gold Antifade Reagent（美國Invitrogen公司）封片。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜（第2版）明確區(qū)分4個目的腦區(qū)，用OLYMPUS全自動虛擬切片掃描系統(tǒng)（VS120）對目的腦區(qū)的熒光圖像進(jìn)行掃描拍攝（20倍干物鏡）。使用Image J軟件的圖像閾值測量工具對目的腦區(qū)感興趣區(qū)域（ROI）的c-Fos免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。每組任選3只小鼠的腦切片行免疫熒光染色，每只小鼠選取4個有代表性的目的腦區(qū)染色切片進(jìn)行圖像采集，每張圖像上選取3個不同的ROI進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。選取ROI的大小為1 mm2。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果以±s形式表示，應(yīng)用Graph Pad Prism 6.0軟件對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。B、C組小鼠禁錮前后在高架十字迷宮開放臂停留時間及進(jìn)入開放臂次數(shù)的比較采用配對t檢驗;3組小鼠各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Dunnett法比較B、C組與A組的差異，用Tukey法比較B、C組的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 高架十字迷宮實驗

B組小鼠禁錮前后在開放臂的停留時間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)差異均無顯著意義（P>0.05）;C組小鼠禁錮后在開放臂的停留時間較禁錮前明顯縮短，進(jìn)入開放臂的次數(shù)較禁錮前明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.364、6.386，P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較

B組各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)較A組明顯增加（F=13.4～645.0，q=5.1～31.6，P<0.01）;C組HY和BLA腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)亦較A組明顯增加（q=3.0、3.0，P<0.05），但mPFC和vHPC腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)與A組相比差異無顯著性（P>0.05）;B組mPFC、BLA及vHPC腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)與C組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=13.8～43.3，P<0.01），但HY腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)的增加并不明顯（P>0.05）。見表2。

3 討 ?論

常用的動物焦慮抑郁模型主要包括應(yīng)激模型、藥理學(xué)模型、分養(yǎng)模型及腦組織損傷模型等。作為一種經(jīng)典的單一性應(yīng)激源焦慮模型，反復(fù)禁錮應(yīng)激可明顯誘發(fā)小鼠的焦慮表型。雖然不同的研究中，每天應(yīng)激時長及應(yīng)激持續(xù)天數(shù)各不相同，但小鼠焦慮表型明顯的這段時間通常被認(rèn)為是焦慮態(tài)時間窗[14-16]。本研究應(yīng)用的是連續(xù)4 d反復(fù)禁錮亞急性應(yīng)激模型。我們的前期研究顯示，在禁錮后的7～12 d，小鼠的焦慮表型明顯，即這段時間為小鼠的焦慮表型時間窗，而4 d禁錮剛結(jié)束時，小鼠仍處于應(yīng)激狀態(tài)，其焦慮表型并不明顯。本研究借助高架十字迷宮實驗，對各組小鼠的焦慮水平進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，反復(fù)禁錮后7 d，小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，即在開放臂的停留時間明顯縮短，進(jìn)入開放臂的次數(shù)也明顯減少;而反復(fù)禁錮后90 min小鼠在開放臂的停留時間及進(jìn)入開放臂的次數(shù)僅有縮短或減少的趨勢，與對照組相比差異無顯著性。

c-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白。基礎(chǔ)狀態(tài)下，c-Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平非常低甚至無表達(dá)，而在各種應(yīng)激刺激后，c-Fos蛋白的表達(dá)能夠被快速誘導(dǎo)。在應(yīng)激后的1～2 h，c-Fos蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰，然后逐漸衰減[17]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)c-Fos蛋白的表達(dá)依賴于應(yīng)激源的內(nèi)在特性、強(qiáng)度和持續(xù)時間。由于c-Fos蛋白的表達(dá)能在很大程度上反映刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元活動，故常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物[18]。本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測了各組小鼠不同腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，反復(fù)禁錮后90 min，小鼠mPFC、HY、BLA及vHPC這4個焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos的表達(dá)水平與對照組相比均明顯增加，而反復(fù)禁錮后7 d小鼠僅HY和BLA腦區(qū)c-Fos的表達(dá)顯著高于對照組，mPFC和vHPC腦區(qū)c-Fos表達(dá)雖有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與相關(guān)文獻(xiàn)描述的c-Fos蛋白的表達(dá)變化情況一致[17]。值得注意的是，本研究還顯示，反復(fù)禁錮后7 d小鼠的焦慮樣表型明顯，同時c-Fos蛋白在HY和BLA腦區(qū)仍有較高的表達(dá)，提示這兩個腦區(qū)更有可能參與反復(fù)禁錮應(yīng)激后焦慮情緒的調(diào)節(jié)，從而與小鼠的焦慮樣行為密切相關(guān)。

以往的相關(guān)研究多采用急性應(yīng)激刺激，包括電擊、空瓶刺激、強(qiáng)迫游泳、寒冷、次聲、急性社交挫敗等[19-24]。急性應(yīng)激刺激誘發(fā)的c-Fos表達(dá)部位涉及額葉皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)、中央杏仁核、前連合核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核彌散部、下丘腦室旁核、室周核、弓狀核、孤束核、丘腦外側(cè)備核、伏隔核、終紋床核等。慢性應(yīng)激后，c-Fos的表達(dá)部位主要涉及下丘腦室旁核、室周核、弓狀核、vHPC、背側(cè)海馬、mPFC、杏仁核、前扣帶皮質(zhì)、紋狀體、伏隔核等[22，25-28]。本研究應(yīng)用的是4 d反復(fù)禁錮亞急性應(yīng)激方式，實驗結(jié)果顯示，4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激誘導(dǎo)的c-Fos在目的腦區(qū)均有表達(dá)，提示這種持續(xù)時間在2周以內(nèi)的亞急性應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的c-Fos表達(dá)腦區(qū)分布更接近于以往報道的慢性應(yīng)激刺激。另外，本研究在高架十字迷宮測試結(jié)束后立即進(jìn)行灌注取腦，因此十字迷宮測試本身不會引起c-Fos蛋白的表達(dá)。

綜上所述，4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激可誘導(dǎo)小鼠HY和BLA等焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的持續(xù)增加，并與小鼠的焦慮樣行為表型密切相關(guān)，提示這些腦區(qū)可能參與了反復(fù)禁錮應(yīng)激后焦慮情緒的調(diào)節(jié)。本實驗為后續(xù)深入研究上述核團(tuán)參與焦慮相關(guān)行為調(diào)控的突觸和神經(jīng)環(huán)路機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)，并為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等應(yīng)激障礙性精神疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] FELIX-ORTIZ A， BEYELER A， SEO C， et al. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors[J]. Neuron， 2013，79（4）：658-664.

[2] GWENDOLYN G C， KAY M T. Resolving the neural circuits of anxiety[J]. Nature Neuroscience， 2015，18（10）：1394-1404.

[3] LI K， NAKAJIMA M， IBAEZ-TALLON I， et al. A cortical circuit for sexually dimorphic oxytocin-dependent anxiety behaviors[J]. Cell， 2016，167（1）：60-72.e11.

[4] LAU T， BIGIO B， ZELLI D， et al. Stress-induced structural plasticity of medial amygdala stellate neurons and rapid prevention by a candidate antidepressant[J]. Molecular Psychiatry， 2017，22（2）：227-234.

[5] DESLAURIERS J， TOTH M， DER-AVAKIAN A， et al. Current status of animal models of posttraumatic stress disorder： behavioral and biological phenotypes， and future challenges in improving translation[J]. Biological Psychiatry， 2018，83（10）：895-907.

[6] WANG Zhuo， ZENG Yuanning， YANG Peng， et al. Axonal iron transport in the brain modulates anxiety-related behaviors[J]. Nature Chemical Biology， 2019，15（12）：1214-1222.

[7] TU Boxuan， WANG Laifa， ZHONG Xiaolin， et al. Acute restraint stress alters food-foraging behavior in rats： taking the easier way while suffered[J]. Brain Research Bulletin， 2019，149：184-193.

[8] ZHANG Junyu， LIU Taohui， YE He， et al. Chronic stress remodels synapses in an amygdala circuit-specific manner[J]. Biological Psychiatry， 2019，85（3）：189-201.

[9] DE LIMA M E， COLPO A C， MAYA-LPEZ M， et al. Comparing the effects of chlorogenic acid and Ilex paraguariensis extracts on different markers of brain alterations in rats subjected to chronic restraint stress[J]. Neurotoxicity Research， 2019，35（2）：373-386.

[10] ZHANG Wenjuan， CAO Wenyu， HUANG Yanqing， et al. The role of miR-150 in stress-induced anxiety-like behavior in mice[J]. Biosciences， 2018，35（1）：160-172.

[11] SALEHI A， RABIEI Z， SETORKI M. Effect of Gallic acid on chronic restraint stress-induced anxiety and memory loss in male BALB/c mice[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences， 2018，21（12）：1232-1237.

[12] ALFONSO-GONZALEZ C， RIESGO-ESCOVAR J R. Fos metamorphoses： lessons from mutants in model organisms[J]. Mechanisms of Development， 2018，154：73-81.

[13] 張頎，阮晶晶. 小鼠在強(qiáng)迫游泳應(yīng)激下腦區(qū)激活情況的研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊， 2019，21（8）：476-479.

[14] 賈晶晶，石天堯，周文霞. 束縛應(yīng)激與單程長時應(yīng)激致小鼠焦慮障礙的應(yīng)激參數(shù)比較與優(yōu)化[J]. 國際藥學(xué)研究雜志， 2019，46（2）：109-115.

[15] 朱明好，蔣寧，周文霞. 不確定性空瓶飲水刺激法和束縛應(yīng)激法建立小鼠焦慮模型及比較[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2019，33（2）：102-108.

[16] HE Zixuan，SONG Huifang，LIU Tingyu， et al. HuR in the medial prefrontal cortex is critical for stress-induced synaptic dysfunction and depressive-like symptoms in mice[J]. Cerebral Cortex， 2019，29（6）：2737-2747.

[17] FARIVAR R， ZANGENEHPOUR S， CHAUDHURI A. Cellular-resolution activity mapping of the brain using immediate-early gene expression[J]. Frontiers in Bioscience， 2004，9（1/3）：104-109.

[18] LIN W. Review and research ideas on psychoneuroimmunology[J]. Acta Psychologica Sinica， 1997，29（3）：301-305.

[19] GOLAM M， CHOWDHURY I， FUJIOKA T， et al. Induction and adaptation of Fos expression in the rat brain by two types of acute restraint stress[J]. Brain Research Bulletin， 2000，52（3）：171-182.

[20] CHEN X， HERBERT J. Alterations in sensitivity to intracerebral vasopressin and the effects of a V1a receptor antagonist on cellular， autonomic and endocrine responses to repeated stress[J]. Neuroscience， 1995，64（3）：687-697.

[21] BRUIJNZEEL A W， STAM R， COMPAAN J C， et al. Long-term sensitization of Fos-responsivity in the rat central nervous system after a single stressful experience[J]. Brain Research， 1999，819（1/2）：15-22.

[22] 姚敏，金玉祥，郭紅，等. 慢性應(yīng)激對大鼠腦內(nèi)FOS的表達(dá)與NO含量的影響[J]. 白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2003，1（3）：136-139.

[23] 邵楓，林文娟，王瑋雯，等. 情緒應(yīng)激對不同腦區(qū)c-fos表達(dá)的影響[J]. 心理學(xué)報， 2003，35（5）：685-689.

[24] NUMA C， NAGAI H， TANIGUCHI M， et al. Social defeat stress-specific increase in c-Fos expression in the extended amygdala in mice： involvement of dopamine D1 receptor in the medial prefrontal cortex[J]. Scientific Reports， 2019，9（1）：1-9.

[25] 嚴(yán)燦，徐志偉，吳麗麗，等. 慢性心理應(yīng)激大鼠下丘腦環(huán)核苷酸和不同腦區(qū)核團(tuán)c-fos蛋白表達(dá)及加味四逆散的影響[J]. 中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)， 2005，14（3）：196-198.

[26] 崔建梅，郭旭玥，于芳，等. 自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及室旁核c-fos表達(dá)的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志， 2016，36（13）：3095-3098.

[27] LIU Lumin， LIU Hui， HOU Yuchao， et al. Temporal effect of electroacupuncture on anxiety-like behaviors and c-Fos expression in the anterior cingulate cortex in a rat model of post-traumatic stress disorder[J]. Neuroscience Letters， 2019，711：134432.

[28] ANDRIJANA S， IVANA P， PETER G， et al. Brain sub/region-specific effects of olanzapine on c-Fos expression of chro-nically socially isolated rats[J]. Neuroscience， 2019，396：46-65.

（本文編輯 馬偉平）