八仙草等3味中草藥復方制劑醇提物的抑制葡萄球菌效果研究

趙錦慧，張帆，張永亮，楊明生

(周口師范學院 生命科學與農(nóng)學學院，河南 周口 466001)

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，有"嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染.目前對此致病菌的治療多使用抗生素，但隨著抗生素的不斷更新和不合理應(yīng)用，病原菌的耐藥性逐步增強，抗生素的療效逐步減退，而中草藥一方面不易產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，另一方面還可提高機體免疫力及抵抗力，因此，尋找對金黃色葡萄球菌抑制作用良好而毒副作用又小的中草藥具有一定意義.有關(guān)八仙草、黃芩和蛇床子的單方制劑抑菌作用已有相關(guān)報道[1-4]，但有關(guān)這3種中草藥組配的復方制劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用未見報道，本研究通過測定最低抑菌濃度、最小殺菌濃度和抑菌圈大小等指標，對八仙草等3味中草藥配伍的復方制劑醇提物的抑菌作用進行研究，為研制開發(fā)綠色環(huán)?？咕胁菟幹苿┨峁﹨⒖?

1 儀器和材料

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、干燥箱、超凈工作臺等.

1.2 試驗材料

八仙草(Galium aparine)，全草入藥，炮制方法為全草洗凈后曬干或晾干；黃芩(Scutellaria baicalensis)，根入藥，炮制方法為黃芩根洗凈后蒸20 min，取出，切薄片，晾干(注意避免暴曬)或80 ℃下烘干；蛇床子(Cnidium monnieri)，種子入藥，炮制方法為割下全株曬干，打落種子，去凈雜質(zhì)即可.3種藥材均購于周口市同和堂大藥店.

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)標準菌株ATCC25923，由周口市中醫(yī)院提供.

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按照蔡信之[5]方法制備.

2.2 八仙草等3味中草藥組配的復方制劑的醇提物制備

將八仙草、黃芩、蛇床子各自粉碎，過40目篩，按不同比例混合組配復方(復方1為八仙草∶黃芩∶蛇床子=1∶1∶1；復方2為八仙草∶黃芩∶蛇床子=2∶1∶1；復方3為八仙草∶黃芩∶蛇床子=1∶2∶1；復方4為八仙草∶黃芩∶蛇床子=1∶1∶2)，分別稱取各復方混合粉末30 g，加95%乙醇80 ℃下回流提取3次，每次1.5 h，將3次濾液合并，離心后取上清液，揮干溶劑后為醇提物，用少量無水乙醇溶解此醇提物，再用蒸餾水稀釋至含生藥300 mg·mL-1，乙醇終濃度為10%，調(diào)節(jié)pH值為7.2，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆?

2.3 藥液稀釋

采用倍比稀釋法，將300 mg·mL-1的醇提液用無菌水稀釋成質(zhì)量濃度分別為150 mg·mL-1，75 mg·mL-1，37.5 mg·mL-1，18.75 mg·mL-1，9.375 mg·mL-1，用于抑菌圈試驗；同法將300 mg·mL-1的醇提液用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋成質(zhì)量濃度分別為150 mg·mL-1，75 mg·mL-1，37.5 mg·mL-1，18.75 mg·mL-1，9.375 mg·mL-1，制成藥液培養(yǎng)基，用于最低抑菌濃度和最小殺菌濃度測定試驗.

2.4 菌種活化及具有合適稀釋度菌懸液的制備

菌種活化參考崔曉峰[6]等方法.采用菌懸液OD值測定及平板菌落計數(shù)法調(diào)節(jié)菌懸液稀釋度，使菌體密度為103cfu·mL-1.

2.5 抑菌圈試驗

采用濾紙片擴散法測抑菌圈大小.首先制備若干直徑6 mm的濾紙片，干熱滅菌后放在不同質(zhì)量濃度的醇提液中浸泡約3 h，對照1(CK1)用無菌水浸泡，對照2(CK2)用10%的乙醇浸泡，各組浸泡完成后，將濾紙片取出晾干備用；再將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板，吸取菌體密度為103cfu·mL-1的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL涂布平板；最后將晾干的濾紙片均勻放置于平板上，每個平板放3片，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察是否有抑菌圈出現(xiàn).每個處理設(shè)置3個重復.用平均數(shù)±標準差表示抑菌圈大小.

抑菌結(jié)果判定標準參考紀莉蓮[7]等方法：抑菌圈<10 mm，表示不敏感；10～11 mm表示輕度敏感；11～16 mm，表示中度敏感；16～20 mm，表示高度敏感.

2.6 最低抑菌濃度(MIC)測定試驗

分別吸取不同質(zhì)量濃度的藥液培養(yǎng)基5 mL于試管中，對照管1(CK1)加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL，對照管2(CK2)加含乙醇10%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL，再往各管加入菌體密度為103cfu·mL-1的菌懸液0.1 mL，于37 ℃下振蕩培養(yǎng)，24 h后觀察試驗結(jié)果，以管中未見渾濁現(xiàn)象的最低藥液濃度作為MIC.

2.7 最小殺菌濃度(MBC)測定試驗

依據(jù)MIC 測定結(jié)果，從未見渾濁現(xiàn)象的各管培養(yǎng)物中吸取 0.1 mL 涂布平板，培養(yǎng)24 h(37 ℃)后觀察結(jié)果，菌落數(shù)少于5個的最低藥液濃度即是最小殺菌濃度.

2.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0和EXCEL軟件進行統(tǒng)計分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 各復方制劑對金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗

各復方制劑對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小見表1.由表1可知，CK1 和CK2對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用，熊平源[8]報道，乙醇對金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923的最低殺菌濃度為20%，本試驗中，金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923對10%的乙醇(CK2)表現(xiàn)并不敏感，這與熊平源的研究結(jié)果一致.表1還顯示，隨著各復方制劑藥液質(zhì)量濃度的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)減小趨勢，并且各質(zhì)量濃度之間差異顯著；相同質(zhì)量濃度下，各復方制劑之間的抑菌圈直徑差異極顯著，抑菌效果最好的為復方3，其藥液質(zhì)量濃度≥75 mg·mL-1時金黃色葡萄球菌對其表現(xiàn)高度敏感，最差的為復方4，其藥液質(zhì)量濃度為300 mg·mL-1時金黃色葡萄球菌對其表現(xiàn)中度敏感.這說明4個復方制劑對金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，抑菌效果強弱與藥液質(zhì)量濃度及3種中草藥配伍比例關(guān)系密切.

表1 各復方制劑對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

注：同列不同小寫字母表示在a=0.05水平上有統(tǒng)計學意義，同行不同大寫字母表示在a=0.01水平上有統(tǒng)計學意義.

Note: Different small letters within the same column indicates that difference is statistically significant at 0.05 level, different capital letters in the same line indicates that difference is statistically significant at 0.01 level.

3.2 各復方制劑對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)試驗

4個復方制劑下金黃色葡萄球菌生長狀況見表2，4個復方制劑對金黃色葡萄球菌的MIC與MBC統(tǒng)計結(jié)果見表3.表2顯示，復方3各管中均未見渾濁現(xiàn)象；復方2醇提物質(zhì)量濃度為9.375 mg·mL-1時，管中輕度渾濁，其余各管未見渾濁；復方1醇提物質(zhì)量濃度≤18.75 mg·mL-1時，管中可見渾濁；復方4醇提物質(zhì)量濃度≤37.5 mg·mL-1時，管中可見不同程度的渾濁現(xiàn)象.表3顯示，復方3的MIC和MBC均為9.375 mg·mL-1，在4個復方制劑中對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好；復方4的MIC和MBC分別為75 mg·mL-1和150 mg·mL-1，在4個復方制劑中的抑菌效果最差.

表2 各復方制劑下金黃色葡萄球菌生長狀況

注：“-”表示管中無渾濁；“+”表示管中輕度渾濁；“++”表示管中中度渾濁；“+++” 表示管中高度渾濁.

Note: “-” indicates no turbidity in tube; “+” indicates slightly turbid in tube; “++” indicates medium turbidity in tube; “+++” indicates highly turbid in tube.

表3 各復方制劑對金黃色葡萄球菌的MIC與MBC

4 討論

本試驗中，蛇床子在復方1、復方2、復方3、復方4中所占比例分別為1/3、1/4、1/4、1/2，黃芩在復方1、復方2、復方3、復方4中所占比例分別為1/3、1/4、1/2、1/4，八仙草在復方1、復方2、復方3、復方4中所占比例分別為1/3、1/2、1/4、1/4，4個復方制劑的抑菌效果為復方3>復方2>復方1>復方4.從3味中草藥在各復方制劑中所占比例及各復方制劑的抑菌效果看，黃芩所占比例最高時，復方制劑抑菌效果最好，蛇床子所占比例最高時，復方制劑抑菌效果最差，八仙草所占比例最高時，其抑菌效果介于二者之間.這可能因為3味中草藥的醇提物對金黃色葡萄球菌的抑制程度不同，黃芩>八仙草>蛇床子；也可能是黃芩所占比例最高時，3味中草藥醇提物所含化學成分能相互充分作用，獲得較好的抑菌效果.

本試驗在制備各復方制劑醇提物時，乙醇濃度為95%，提取溫度為80 ℃，提取次數(shù)為3次，提取條件和提取方法不同可能會影響中草藥最終有效成分的溶出量，因此本試驗條件下獲得的結(jié)果可能與前人試驗結(jié)果并不一致.

本試驗進行的是體外抑菌研究，由于各復方制劑醇提物在體內(nèi)外的抑菌效果可能并不相同，因此，本試驗所涉及的各復方制劑醇提物的體內(nèi)抑菌效果有待進一步探討.此外，在分子水平上闡明各復方制劑醇提物的抑菌機理也有待于進一步探討.

[1]趙錦慧，賴穎，胡春紅．八仙草提取物對兩種常見致病菌的抑制效果[J]．時珍國醫(yī)國藥，2013，24(2)：390-391．

[2]張有志，李存保，楊麗敏．黃芩提取物對金黃色葡萄球菌體內(nèi)外抑菌作用的實驗研究[J]．科學技術(shù)與工程， 2014，14(21)：191-194．

[3]崔一喆，耿仁德，王秋菊，等．黃芩提取物對常見致病菌的體內(nèi)外抑菌活性測定[J]．黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2015，27(1)：33-36．

[4]王興華，劉大芳，徐軍，等．苦參蛇床子等六種藥用植物的抑菌研究[J]．山西大學學報(自然科學版),1999，22(4)：383-386．

[5]蔡信之．微生物學(2版)[M]．北京：高等教育出版社，2002：394-395．

[6]崔曉峰，黃永蓮．茶籽浸提液抑菌作用研究[J]．嶺南師范學院學報，2016，37(3)：98-102．

[7]紀莉蓮，范怡梅．土茯苓體外抗菌活性實驗[J]．中國生化藥物雜志，2002，23(5)：239．

[8]熊平源，邊藏麗，張萬明，等．乙醇消毒液污染調(diào)查及其殺菌效果觀察[J]．中國消毒學雜志，2008，25(4)：435-436 ．