三種地生蘭根際真菌的分離與檢測(cè)

范繼紅　陳蘭芬　湯久楊

摘要：選取蘭屬的春蘭、春劍和寒蘭3種地生蘭，對(duì)其栽培基質(zhì)中的根際真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)后得到3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，并以18SDNA序列擴(kuò)增鑒定為米根霉（Rhizopus oryaze）、球毛殼菌（Chaetomium lobasum）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus），通過(guò)對(duì)蘭花根系進(jìn)行染色顯微觀察，發(fā)現(xiàn)蘭花根與真菌共生形成的菌根結(jié)構(gòu)，為蘭科植物根際真菌研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：地生蘭;根際真菌;分離;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S682.31? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）04-0088-03

Abstract： Three Chinese terrestrial orchids Cymbidium goeringii， Cymbidium tortisepalum Fukuy.var. longibracteatum and Cymbidium kanran were chosen to the samples for isolating and culturing rhizosphere fungi from substrates， which found and identificated three preponderant fungal strains during the storage， and which identified as Rhizopus oryaze， Chaetomium lobasum， Rhizopus icrosporus by 18SDNA sequences. It was found that the roots of orchid were mutualized with fungi to form rhizosphere structure， according to orchid roots stained and microscopical observed， so as to provide a theoretical basis for further research of orchids rhizosphere fungi.

Key words： orchid; rhizosphere fungi; separate; testing

蘭科（Orchidaceae）是有花植物中最大的科，全世界蘭科植物約有26 000種，廣泛分布于各種陸地生態(tài)系統(tǒng)中[1]。菌根（Mycorrhiza）作為自然界中極為普遍和重要的共生現(xiàn)象，是植物在長(zhǎng)期生存進(jìn)化過(guò)程中與菌根真菌一起協(xié)同進(jìn)化的產(chǎn)物[2]。幾乎所有的蘭科植物都與真菌共生，蘭科菌根共生關(guān)系幾乎伴隨著蘭科植物從種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)果的整個(gè)生活史[3]，大多數(shù)成年的蘭科植物仍需菌根真菌提供生長(zhǎng)所需的碳水化合物及有機(jī)質(zhì)，如氨基酸、維生素等[4]。

本試驗(yàn)選取蘭屬的春蘭[Cymbidium goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、春劍（Cymbidium tortisepalum Fukuy. var. longibracteata）和寒蘭（Cymbidium kanran）3種地生蘭，對(duì)其栽培基質(zhì)中的根際菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)得到3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，并以18SDNA方法擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。通過(guò)對(duì)蘭花根系染色顯微觀察，發(fā)現(xiàn)了蘭花根與真菌共生形成的菌根結(jié)構(gòu)，以期為研究蘭花根際真菌提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 供試植物

供試植物：春蘭，采集地為貴州省黔西南州興義市;春劍，采集地為四川省雅安市;寒蘭，采集地為福建省漳州市。

1.2? 栽培基質(zhì)

栽培基質(zhì)采用松樹(shù)皮基質(zhì)，采購(gòu)于北京大漢園景科技有限公司，顆粒大小大約2 cm2，基質(zhì)采用松樹(shù)皮+草炭+珍珠巖混合，混合比例為松樹(shù)皮∶草炭∶珍珠巖=1∶1∶1。

1.3? 種苗栽培

栽植盆選用塑料盆，規(guī)格為上口徑15 cm，盆底直徑12 cm，高15 cm，栽培前修剪爛根、空根，待根系變軟發(fā)白后再栽入盆中，每10 d澆水一次，每隔一月澆一次花多多氮磷鉀三元復(fù)合肥（氮∶磷∶鉀為20∶20∶20）營(yíng)養(yǎng)液。

1.4? 試驗(yàn)方法

菌種分離Czapek培養(yǎng)基，根際菌種類型鑒定采用18SDNA序列測(cè)序，菌根侵染狀況采用KOH透明-藍(lán)墨水染色法測(cè)定，菌根侵染率以被侵染的根段數(shù)占鏡檢總根段數(shù)的百分率表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 3種國(guó)蘭栽培基質(zhì)根際菌種分離

通過(guò)Czapek培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3種優(yōu)勢(shì)菌株，將3種優(yōu)勢(shì)菌株分離培養(yǎng)后進(jìn)行18SDNA序列測(cè)序，確定3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株分別為米根霉（Rhizopus oryaze）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus）、球毛殼菌（Chaetomium lobasum）（表1、圖1）。從表1可以看出，春蘭、春劍、寒蘭3種國(guó)蘭均發(fā)現(xiàn)了米根霉，屬于優(yōu)勢(shì)菌種;在春蘭和寒蘭中都分離出了球毛殼菌，可以歸為亞優(yōu)勢(shì)種或伴生種;小孢根霉僅在春劍中發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)其在蘭花生長(zhǎng)中的作用。從圖1可以看出，在對(duì)菌種培養(yǎng)過(guò)程中，每種培養(yǎng)基上都出現(xiàn)了2種不同的菌落，春蘭和寒蘭均以米根霉白色菌絲為主，春劍中米根霉和小孢根霉分布比較平均。

2.2? 3種國(guó)蘭根內(nèi)菌根結(jié)構(gòu)及侵染率觀察

通過(guò)取樣鏡檢發(fā)現(xiàn)，3種蘭花的根系都發(fā)現(xiàn)了菌根結(jié)構(gòu)，春蘭發(fā)現(xiàn)的菌根結(jié)構(gòu)主要為細(xì)胞內(nèi)的聚生結(jié)構(gòu)，數(shù)量較多，春劍和寒蘭的菌根結(jié)構(gòu)主要發(fā)現(xiàn)的是細(xì)胞間菌絲較多，菌絲粗大，分支不明顯，在與細(xì)胞的侵染點(diǎn)處有明顯的分支。通過(guò)鏡檢計(jì)數(shù)，春蘭的菌根感染率比較高，達(dá)到35%（圖2至圖4）。

通過(guò)鏡檢計(jì)數(shù)，3種國(guó)蘭的菌根侵染率均在30%以上，其中春蘭的菌根感染率比較高，達(dá)到35%，寒蘭的菌根感染率為32%，春劍的菌根感染率為30%。

3? 小結(jié)與討論

蘭科植物是典型的菌根植物，不僅在種子萌發(fā)階段與真菌有著密不可分的聯(lián)系，在幼苗和成年期仍需要真菌為其提供營(yíng)養(yǎng)，蘭科植物在生長(zhǎng)的不同時(shí)期需要不同的真菌與其共生。

本試驗(yàn)分離出的3個(gè)菌株都屬于腐生菌類的根霉屬和毛殼菌屬，根霉屬為毛霉科真菌中的一個(gè)大屬，廣泛分布于酒曲、植物殘?bào)w、腐敗有機(jī)物、動(dòng)物糞便和土壤中，還沒(méi)發(fā)現(xiàn)關(guān)于根霉與蘭花形成的菌根。毛殼菌屬是腐生子囊菌中數(shù)量最多和意義較大的類群之一，毛殼菌的大多數(shù)種類都有降解纖維素的能力，某些類群還具有重要的醫(yī)用價(jià)值，已有關(guān)于從石斛蘭中分離到毛殼菌的報(bào)道[5]。本試驗(yàn)分離到的3個(gè)菌株是否是與蘭花形成的菌根有待進(jìn)一步接種試驗(yàn)驗(yàn)證。

通過(guò)染色鏡檢觀察到了蘭花根系的細(xì)胞內(nèi)菌絲團(tuán)和胞間菌絲狀況，侵染率大約都在30%左右。菌根結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，侵染率不是很高，可能與使用人工加工的松樹(shù)皮栽培基質(zhì)微生物類群簡(jiǎn)單有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蓋雪鴿，邢曉科，郭順星.蘭科菌根的生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào)，2014，33（4）：753-767.

[2] 李曉林，馮? 固.叢枝菌根生理生態(tài)[M].北京：華文出版社，2001.

[3] DEARNALEY J D W. Further advances in orchid mycorrhizal research[J].Mycorrhiza，2007，17： 475-486.

[4] SMITH S E，READ D. Mycorrhizal symbiosis，3rd edition[M].New York：Elsevier，2008.

[5] 李? 明.蘭花菌根研究及應(yīng)用[M].昆明：云南大學(xué)出版社，2006.