不明原因復發(fā)性流產患者接受淋巴細胞免疫治療的效果預評估指標研究

陳麗莉 陳建安 朱學海 余暉 丁茜 劉曉彤

【摘要】 目的：探討對不明原因復發(fā)性流產患者的淋巴細胞免疫治療效果具有預評估價值的指標，為免疫治療提供臨床參考。方法：選取2016年10月-2018年10月在筆者所在醫(yī)院就診并自愿接受淋巴細胞免疫治療的不明原因復發(fā)性流產患者94例，比較相同治療周期時，封閉抗體轉為強陽性組與弱陽性組在治療前外周血淋巴細胞亞群比例和治療后兩組的再發(fā)自然流產率差異;比較不同治療周期時，封閉抗體經一療程治療轉為陽性組與兩療程治療轉為陽性組的再發(fā)自然流產率差異。結果：相同治療周期，封閉抗體強陽性組治療前CD3+CD8+T淋巴細胞比例高于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;封閉抗體強陽性組在孕16周前再發(fā)自然流產率低于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;不同治療周期，封閉抗體經一療程治療轉為陽性組與兩療程治療轉為陽性組在孕16周前的再發(fā)自然流產率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：外周血CD3+CD8+T淋巴細胞可預評估免疫治療后封閉抗體的陽性強度，而封閉抗體陽性強度與孕16周前的再發(fā)自然流產率相關。暫未發(fā)現封閉抗體轉為陽性的治療周期對孕16周前的再發(fā)自然流產率具有預評估價值。

【關鍵詞】 封閉抗體 淋巴細胞亞群 不明原因復發(fā)性流產 淋巴細胞免疫治療

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.006 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）12-00-03

Study on the Pre-evaluation Index of Lymphocyte Immunotherapy in Patients with Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion/CHEN Lili， CHEN Jianan， ZHU Xuehai， YU Hui， DING Qian， LIU Xiaotong. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -16

[Abstract] Objective： To explore the indexes of pre-evaluation for lymphocyte immunotherapy in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion， and to provide clinical reference for immunotherapy. Method： From October 2016 to October 2018 in our hospital， 94 cases of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion voluntarily accepted the lymphocyte immune treatment were selected. In the same treatment cycle，the differences in the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets before treatment and the rate of recurrent spontaneous abortion after treatment were compared between the strongly and the weakly positive group with blocking antibody. In the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and the positive group after two courses of treatment were compared. Result： With the same treatment cycle， the proportion of CD3+CD8+T lymphocytes before treatment in the strongly positive group with blocking antibody was higher than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The rate of recurrent spontaneous abortion in the strongly positive group with blocking antibody before 16 weeks of pregnancy was lower than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. With the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and that after two courses of treatment was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Peripheral CD3+CD8+T lymphocytes can pre-evaluate the positive intensity of blocking antibody after immunotherapy， and the positive intensity of blocking antibody is related to the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy. It is not found that the treatment cycle of blocking antibody to positive had a pre-evaluation value on the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy.

[Key words] Blocking antibody Lymphocyte subsets Unexplained recurrent spontaneous abortion Lymphocyte immunotherapy treatment

First-authors address： Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Dongguan 523000， China

國內多項研究認為，丈夫外周血淋巴細胞免疫治療（lymphocyte immunotherapy treatment，LIT）可用于治療不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1-3]，其原理為LIT可誘導母體產生封閉抗體（blocking antibody，BA），BA能抑制母體免疫系統(tǒng)識別和殺傷胚胎，從而產生免疫保護作用[4-5]。盡管LIT的療效得到普遍認同，但目前對預評估LIT療效的指標少有報道，而預評估指標可指導治療方案的制定，提高治療效果。因此本次研究擬對筆者所在醫(yī)院自愿接受LIT的URSA患者進行療效追蹤和相關指標回顧分析，旨在研究對LIT的治療效果具有預評估價值的指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月-2018年10月在中山大學附屬東華醫(yī)院就診且自愿接受LIT的URSA患者94例。納入標準：女方連續(xù)3次以上自然流產且封閉抗體陰性;通過分泌物檢查排除生殖器感染;通過超聲或宮腔鏡排除生殖器異常及其他病變;抗子宮內膜抗體、抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體、抗精子抗體、抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體均為陰性;凝血功能正常。男方精液常規(guī)正常、抗精子抗體為陰性。同時，夫妻雙方的支原體、衣原體、乙肝病毒、HIV、梅毒抗體、TORCH-IgM病毒抗體均為陰性;染色體核型分析正常且非近親結婚;研究對象以往均未接受過淋巴細胞主動免疫治療。排除標準：合并其他基礎疾病;通過人工輔助妊娠。患者年齡24～42歲，平均（31.0±4.7）歲，流產3～7次，平均（4.2±0.9）次。治療前夫妻雙方均對LIT充分了解并簽署知情同意書。本次研究通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 BA檢測 采集患者肘靜脈血2 ml，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗進行外周血BA檢測，每次檢測均設陰性、陽性和空白對照，檢測步驟及結果判讀嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 外周血淋巴細胞亞群檢測 采集患者肘靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，分別取抗凝全血50 μl加入4個流式細胞計數試管中，再往第1管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD8-ECD/CD4-RD1抗體各5 μl，第2管加入CD45-FITC/CD19-ECD/CD56-RD1抗體各5μl，第3管加入CD45-Cy7/CD4-PE/CD25-FITC抗體各5 μl，第4管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD16-PE/CD56-RD1抗體各5 μl，避光反應20 min后，加入紅細胞裂解液500 μl，避光反應20 min后加入PBS緩沖液，用流式細胞儀分析計算淋巴細胞亞群比例。

1.2.3 淋巴細胞免疫治療（LIT） 采集淋巴細胞供給者外周血30 ml（肝素鈉抗凝），緩緩加入到20 ml淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心30 min，收集中間層細胞放入含6 ml生理鹽水的試管中混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清后用生理鹽水反復洗滌沉淀物2次，最后配制成濃度為2×107～4×107/ml的淋巴細胞懸液。取淋巴細胞懸液在患者手臂內側進行8～10個點皮內注射。每3周1次，4次為一個療程，治療一療程后復查BA，BA轉為陽性即指導妊娠，妊娠后每2周進行LIT一次，妊娠10周后調整治療方案為每3周進行LIT一次，妊娠16周治療結束。治療一療程后BA仍未轉為陽性者，繼續(xù)第二療程治療后再指導妊娠。

1.3 觀察指標

分別觀察LIT前患者外周血淋巴細胞亞群比例與LIT后BA陽性強度;BA陽性強度與LIT后患者再發(fā)自然流產率;BA轉為陽性的LIT療程與LIT后患者再發(fā)自然流產率。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數據分析。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 相同治療周期BA強陽性組與弱陽性組在治療前外周血淋巴細胞亞群比例比較

經一療程治療后，48例患者的BA轉為強陽性，22例患者的BA轉為弱陽性，強陽性組治療前CD3+CD8+T細胞比例高于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而兩者的CD3+T、CD3+CD4+T、CD4+CD25+T、CD19+B、CD56+CD16+NK、CD56+CD16-NK等淋巴細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 相同治療周期BA強陽性組與弱陽性組再發(fā)自然流產率比較

經一療程治療后，BA轉為強陽性者占68.6%（48/70），弱陽性者占31.4%（22/70）。BA強陽性組年齡24～40歲，平均（31.1±4.9）歲，流產3～6次，平均（4.2±0.8）次;BA弱陽性組年齡25～42歲，平均（31.5±4.6）歲，流產3～6次，平均（4.3±0.8）次。兩組患者的年齡及流產次數比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

BA強陽性組中，36例再次妊娠，其中15例在孕期中且孕周超過16周，15已經分娩，2例在孕16周前再次發(fā)生自然流產，1例因染色體異常引產及3例孕周小于16周不列入統(tǒng)計范疇，BA強陽性組孕16周前再發(fā)自然流產率為6.3%（2/32）。BA弱陽性組中，20例再次妊娠，其中9例在孕期中且孕周超過16周，3例已經分娩，6例在孕16周前再次發(fā)生自然流產，2例孕周小于16周不列入研究范疇，BA弱陽性組孕16周前再發(fā)自然流產率為33.3%（6/18）。BA強陽性組在孕16周前再發(fā)自然流產率低于BA弱陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（字2=4.434，P=0.035）。

2.3 BA一療程轉為陽性組與兩療程轉為陽性組的再發(fā)自然流產率比較

94例患者中，70例經一療程治療后BA轉為陽性，22例經兩療程治療后BA轉為陽性，2例經兩療程治療后BA仍為陰性。一療程組年齡24～42歲，平均（31.3±4.5）歲，流產3～6次，平均（4.3±0.8）次;兩療程組年齡25～41歲，平均（30.7±4.3）歲，流產3～7次，平均（4.1±1.0）次，兩組患者的年齡及流產次數比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

在BA轉為陽性的患者中，一療程組中56例再次妊娠，其中24例在孕期中且孕周超過16周，18例已分娩，8例在孕16周前再次發(fā)生自然流產，1例因染色體異常引產以及5例孕周小于16周均不列入統(tǒng)計范疇，一療程組孕16周前再發(fā)自然流產率為16%（8/50）。兩療程組中16例再次妊娠，其中7例在孕期中且孕周超過16周，5例已分娩，2例在孕16周前再次發(fā)生自然流產，2例孕周小于16周不列入統(tǒng)計范疇，兩療程組孕16周前再發(fā)自然流產率為14.3%（2/14）。兩組患者孕16周前再發(fā)自然流產率相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是臨床常見的婦科疾病，對女性患者帶來極大的身心傷害，現已成為目前醫(yī)學上急需解決的醫(yī)學難題之一[6]。在復發(fā)性流產的眾多病因中，同種免疫異常所占比例最高[7]，同種免疫型復發(fā)性流產又被稱為不明原因復發(fā)性流產（URSA）。石瑛等[8]通過進行反復自然流產與BA相關性的Meta分析，認為URSA與BA缺乏有關。BA是妊娠女性血清中含有的針對胚胎人類白細胞抗原Ⅱ和滋養(yǎng)細胞交叉抗原產生的IgG抗體，通過與滋養(yǎng)細胞結合或與母體淋巴細胞表面抗原結合，防止胚胎父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識別觸發(fā)的免疫攻擊[9]。研究顯示，對BA缺乏的URSA患者，經LIT治療后，可誘導BA產生，進而提高淋巴細胞的封閉率，致使調節(jié)性T細胞得到活化和增殖[10]，從而抑制母胎之間的免疫排斥，最終使妊娠率及活產率均顯著升高[11]。然而盡管大多研究證實LIT對URSA患者治療效果明顯[12]，但遺憾的是目前對LIT療效的預評估缺乏相關研究，如對LIT療效預評估指標進行探討，則可進一步細化LIT治療方案，提高治療效果。LIT主要是通過誘導BA產生而發(fā)揮治療效果，但誘導產生的BA的陽性強度差異是否影響再發(fā)自然流產率;BA陽性強度差異的治療前影響因素有哪些;經不同治療周期誘導產生BA的患者的再發(fā)自然流產率是否有差異等，這些都是臨床需要探討的問題，同時亦可為預評估治療效果提供參考。因此本次研究通過對比在相同治療周期內，BA轉為強陽性組與轉為弱陽性組患者在治療前外周血淋巴細胞亞群比例，發(fā)現前者CD3+CD8+T淋巴細胞比例高于后者，差異有統(tǒng)計學意義，而治療后BA強陽性組在孕16周前的再發(fā)自然流產率低于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在不同治療周期內，BA經一療程治療轉為陽性組與兩療程治療轉為陽性組患者比較，兩者孕16周前的再發(fā)自然流產率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

外周血淋巴細胞亞群是人體細胞免疫的重要因素，CD3+CD8+T和CD3+CD4+T是T淋巴細胞的主要組成部分，CD3+CD8+T淋巴細胞主要對CD3+CD4+T淋巴細胞參與的細胞免疫產生抑制[13]。本次研究發(fā)現，治療后BA轉為強陽性組在治療前CD3+CD8+T淋巴細胞比例高于BA轉為弱陽性組，推測CD3+CD8+T淋巴細胞可能間接影響B(tài)A的產生，因此推薦治療前使用CD3+CD8+T淋巴細胞比例預評估LIT誘導BA產生的陽性強度。BA作為一種體液免疫因素，被認為是妊娠成功的一個重要因素[14]。本次研究發(fā)現BA強陽性組孕16周前的再發(fā)自然流產率低于弱陽性組，提示BA的陽性強度與再發(fā)自然流產率相關，建議LIT后觀察BA的陽性強度，對于BA弱陽性的患者，進行鞏固治療后再指導妊娠，可進一步降低再發(fā)自然流產率。另外，本次研究暫未發(fā)現BA轉為陽性的治療周期與孕16周前的再發(fā)自然流產率相關，治療周期能否預評估治療效果尚需更多研究數據論證。

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（收稿日期：2020-02-21） （本文編輯：張亮亮）