糖基化終末產(chǎn)物在青光眼中的研究進展

韓明月，董洪亮，于金璐，王 強

0引言

青光眼是一種威脅和損害視覺通路及視神經(jīng)的疾病，最終導(dǎo)致視覺功能不可逆損害，主要與病理性眼壓升高有關(guān)[1]。視神經(jīng)退行性病變是青光眼最核心的問題，無論何種類型青光眼，都具有這一共同病理損害。我國青光眼患病率居世界首位且患者大多為老年人，大部分患者首診時已經(jīng)是視覺損傷中晚期，預(yù)后較差，因此廣泛、深入的青光眼防治尤為重要。

糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)與葡萄糖或者其他還原糖在非酶條件下生成的穩(wěn)定共價加成物，是非酶糖基化反應(yīng)(米拉德反應(yīng))的終末產(chǎn)物，這種反應(yīng)可以發(fā)生在所有細(xì)胞中(glucose-meditate protein glycation contribution)(圖1[2])。AGEs在體內(nèi)累積并通過激活相關(guān)信號通路等誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成一系列年齡相關(guān)性疾病及神經(jīng)退行性病變，如阿爾茨海默病、帕金森病[2]。AGEs在視網(wǎng)膜等眼組織中累積，通過直接細(xì)胞毒性和與受體結(jié)合產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)等對組織、細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致青光眼的發(fā)生及發(fā)展[3]?，F(xiàn)就AGEs在青光眼中的作用研究進展進行綜述。

1 AGEs來源及生物學(xué)特性

AGEs有兩種重要的來源：內(nèi)源性和外源性[4-5]。內(nèi)源性來源主要是體內(nèi)葡萄糖及某些高活性糖分子(果糖、糖代謝中間產(chǎn)物如6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛等)和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)通過非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)生。還原糖的醛基和大分子物質(zhì)末端的還原性氨基發(fā)生米拉德反應(yīng)生成不穩(wěn)定的希夫堿，這一過程反應(yīng)迅速且高度可逆；數(shù)天后，不穩(wěn)定的希夫堿發(fā)生葡糖胺重排反應(yīng)(Amadori重排)，這一過程緩慢且可逆，但總體朝向Amadori重排產(chǎn)物方向，米拉德反應(yīng)和Amadori重排產(chǎn)生可逆的早期糖基化產(chǎn)物(Amadori重排產(chǎn)物、希夫堿、米拉德產(chǎn)物)，這些中間產(chǎn)物數(shù)量與葡萄糖等還原糖濃度有關(guān)，當(dāng)葡萄糖被清除時，中間產(chǎn)物濃度也會下降；隨后中間產(chǎn)物再經(jīng)脫水等一系列反應(yīng)生成羰基化合物，再與蛋白質(zhì)自由氨基反應(yīng)生成不可逆的晚期AGEs(羥甲基賴氨酸、羥乙基賴氨酸等)。此外，部分還原糖通過糖酵解途徑產(chǎn)生活性α-二羰基(乙二醛、丙酮醛等)，經(jīng)Amadori重排后生成不可逆的晚期AGEs[6-7]。以上反應(yīng)均不需要酶的催化，為非酶糖基化反應(yīng)。

圖1 AGEs的形成和保護調(diào)節(jié)系統(tǒng) AGEs可以由高濃度的血糖通過米拉德反應(yīng)緩慢地形成，也可以通過與α-二羰基反應(yīng)更快地形成。反應(yīng)性二羰基包括甲基乙二醛(MGO)、乙二醛或3-deoxyglucosane (3 DG)。AGEs包括羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、甲基乙二醛衍生物氫咪唑酮(MGH1)等。解毒途徑如乙二醛酶途徑和蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)組成了保護性抗AGEs機制(綠色高亮部分)，這種蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)和自噬。

圖2 眼組織中AGEs的病理生理學(xué) AGEs可以通過(1)細(xì)胞外累積并改變細(xì)胞外基質(zhì)的生化特性；(2)與質(zhì)膜受體結(jié)合，觸發(fā)特定轉(zhuǎn)錄因子的核易位；(3)細(xì)胞內(nèi)形成的AGEs誘導(dǎo)蛋白交聯(lián)，改變蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)，影響蛋白活性。細(xì)胞內(nèi)聚集物水平的升高被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性。

外源性來源是食物中的糖、蛋白質(zhì)、脂肪等通過高溫過度烹飪或者過度加工發(fā)生了非酶糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量AGEs。這些AGEs進入人體后經(jīng)消化吸收進入血液循環(huán)[8-9]，經(jīng)代謝后僅有10%保留下來，其余通過尿液在48h內(nèi)排出[6]。

AGEs在生物體內(nèi)通過以下幾種機制發(fā)揮作用(圖2[2])：(1)細(xì)胞外基質(zhì)中過多沉積的AGEs和穩(wěn)定的長壽蛋白交聯(lián)，減少組織彈性；(2)AGEs直接糖化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等損害細(xì)胞功能；(3)AGEs直接調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達，或者和相應(yīng)細(xì)胞受體結(jié)合來激活相關(guān)細(xì)胞信號通路，改變相應(yīng)的基因表達。AGEs受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是AGE受體類型之一，存在于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中，AGEs與RAGE結(jié)合后誘導(dǎo)p21和MAPK通路活化，繼而引起NF-κB遷移及目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，如生長因子、黏附分子(內(nèi)皮因子-1、VCAM-1等)，還有促炎因子(IL-6、IL-1、TNG-α)，激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激信號通路，產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[10-11]。氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS反過來上調(diào)RAGE表達，兩者相互作用，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織或者細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或者功能損傷。

2 AGEs與青光眼發(fā)病的關(guān)系

2.1 AGEs在青光眼患者中的分布AGEs在青光眼患者眼組織中表現(xiàn)出過多沉積[12]。Hondur等[13]通過對比同等年齡青光眼組和非青光眼組患者的房水和血清發(fā)現(xiàn)，青光眼組患者血清和房水中AGEs含量均明顯高于非青光眼組患者，而且房水中含量高于血清中含量。對比年輕人群和老年人群血清及房水，發(fā)現(xiàn)AGEs在老年人群中的累積增加，這與青光眼好發(fā)于老年人群符合[1]。既往研究[14-15]通過免疫組織化學(xué)等方法檢測青光眼患者眼中AGEs含量，發(fā)現(xiàn)異常AGEs沉積主要在篩板及視乳頭周圍血管、視網(wǎng)膜中。一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和軸突細(xì)胞內(nèi)也檢測出AGEs免疫標(biāo)記。然而，眼組織中增加的AGEs免疫標(biāo)記主要存在于細(xì)胞外。RAGE主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，尤其是Müller細(xì)胞，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)免疫標(biāo)記[16-17]。由以上結(jié)論可知，AGEs在青光眼患者中異常沉積，可能參與了青光眼的發(fā)生及發(fā)展過程。

2.2 AGEs在青光眼中的作用機制AGEs廣泛存在于篩板、視乳頭及周圍視網(wǎng)膜、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等組織細(xì)胞中，并通過以下機制參與了青光眼發(fā)生、發(fā)展的病理過程[3-4]。(1)還原糖與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)后，形成不可溶解的、能抵抗蛋白酶的非降解聚合物。這些AGEs聚集在篩板上導(dǎo)致篩板硬度增加，眼壓作用于篩板直接對視神經(jīng)纖維壓迫增加，阻礙了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸漿流運轉(zhuǎn)代謝和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的獲取，最終導(dǎo)致青光眼的發(fā)生[1]。而且在神經(jīng)元中，這種非降解聚合物可以直接干預(yù)軸漿運輸和細(xì)胞內(nèi)蛋白運輸，增加青光眼發(fā)病的可能性。另外，增加的AGEs還可以沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[18-19]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一些蛋白質(zhì)折疊的場所，AGEs的沉積導(dǎo)致非折疊蛋白質(zhì)增加，非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的活化代表了可選擇的NF-κB活化和細(xì)胞凋亡啟動，最終導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞的凋亡。(2)AGEs通過結(jié)合到特定受體上來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。AGEs受體是免疫球蛋白超家族多配基信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中。AGEs與受體結(jié)合后誘導(dǎo)了p21和MAPK通路活化，緊接著引起NF-κB遷移及目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，包括生長因子、黏附因子、促炎因子等，有證據(jù)表明這些炎癥過程一旦啟動，就會終止于AGEs受體活化和炎癥因子產(chǎn)生的惡性循環(huán)中。而且，AGEs與受體結(jié)合后上調(diào)相關(guān)配基，維持細(xì)胞活化并且促進活性氧產(chǎn)物產(chǎn)生；增加的活性氧產(chǎn)物已被報道通過活化NADPH來上調(diào)AGEs與受體結(jié)合，兩者相互促進，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，誘發(fā)或者加重青光眼病理損傷。張敏等[11]使用AGE-BSA干預(yù)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AGE-BSA可以明顯提高小梁細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且隨著AGE-BSA干預(yù)濃度的增加和時間的延長，小梁細(xì)胞凋亡率也隨之上升。另外，AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞活化引起血管黏附因子和生長因子等表達增加，誘導(dǎo)增殖分化因子釋放，比如轉(zhuǎn)化生長因子-α和白細(xì)胞介素-6，促進了細(xì)胞的活化、增殖、趨化性和血管生成，增加了炎性反應(yīng)的發(fā)生，這些都參與了青光眼的發(fā)生和發(fā)展。(3)細(xì)胞內(nèi)形成的AGEs誘導(dǎo)蛋白交聯(lián)，改變蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)，影響蛋白活性，對細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用?？梢夾GEs通過上述機制，對小梁組織、視神經(jīng)篩板、視網(wǎng)膜等組織造成影響，促進青光眼的發(fā)生發(fā)展。

3 AGEs與青光眼標(biāo)志物關(guān)系

青光眼相關(guān)的分子標(biāo)志物可以提高疾病的早期臨床檢出率，預(yù)測青光眼患者預(yù)后，并且監(jiān)測治療效果。隨著青光眼患者視網(wǎng)膜和視乳頭組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)增加的證據(jù)逐漸被發(fā)現(xiàn)[3-4,20-21]，Hondur等[13]認(rèn)為氧化編輯后的蛋白質(zhì)或者氧化應(yīng)激終末產(chǎn)物可以作為青光眼標(biāo)志物，通過收集了經(jīng)嚴(yán)格篩選的96例患青光眼受試者和64例未患青光眼受試者的血液和房水樣本，通過Elisa來檢測樣本中蛋白質(zhì)羰基及AGEs含量。經(jīng)對比患青光眼受試者血液和房水中蛋白羰基及AGEs水平大幅度升高，并且兩者在房水中的增加比血液中更明顯，青光眼受試者房水和血液中蛋白質(zhì)羰基含量分別是未患青光眼受試者的2.6倍和1.9倍，AGEs分別為3.1倍和1.9倍。雖然通過檢測AGEs含量來篩查青光眼是一種很好的辦法，但房水樣本獲取較困難，多是患者行白內(nèi)障超聲乳化摘除術(shù)時獲取，所以該方法應(yīng)用到臨床實踐中仍需進一步改進。

Meerwaldt等[22]認(rèn)為AGEs累積可以通過非侵入性方法檢測皮膚自發(fā)熒光來評估。血液或者尿液中的AGEs不能反應(yīng)它們在組織中的水平；皮膚自發(fā)熒光，特別是半衰期為15a的皮膚膠原纖維，可以評估組織中AGEs的累積，所以皮膚自發(fā)熒光被認(rèn)為是反應(yīng)累積代謝壓力更好的指標(biāo)。Schweitzer等[23]使用皮膚自發(fā)熒光評估了AGEs累積與開角型青光眼的關(guān)系。他們認(rèn)為高水平的皮膚自發(fā)熒光作為代謝記憶的長期標(biāo)志物，和吸煙一起成為患青光眼風(fēng)險增加的相關(guān)獨立因素[24-25]。作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，AGEs在眼組織中的長期累積在青光眼慢性視神經(jīng)病中起到重要作用。皮膚自發(fā)熒光檢測是一種無創(chuàng)操作，作為普查方法更易被接受，可以大大提高青光眼早期篩查率，及早治療，減少青光眼進展帶來的視功能損害。

4 AGEs與青光眼的治療

AGEs通過多種機制導(dǎo)致青光眼的發(fā)生，相應(yīng)的阻斷AGEs的形成、破壞已經(jīng)交聯(lián)的AGEs、阻止下游反應(yīng)啟動或者抑制其直接細(xì)胞毒性作用成為了當(dāng)前研究青光眼治療的熱點。Kiland等[14]在老年恒河猴玻璃體腔內(nèi)注射了抵抗AGEs交聯(lián)形成的藥物4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物，6mo后通過電鏡和免疫組化等方法觀察眼球前后節(jié)變化。通過觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組AGEs在視乳頭中表達下降，在前節(jié)改變不明顯。此外，對比對照組，實驗組靜脈注射匹羅卡品后房水流出系數(shù)明顯增加，表明4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物對青光眼有一定的治療效果。在青光眼視乳頭篩板和血管中，AGEs累積減弱了篩板軸索支持功能，損傷微循環(huán)，因此導(dǎo)致組織對壓力性軸索損傷的敏感性增加；AGEs與相應(yīng)受體結(jié)合及對細(xì)胞直接毒性作用，這些最終導(dǎo)致青光眼的發(fā)生。4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物的干預(yù)減少了眼組織中AGEs的表達，減少了AGEs帶來的一系列病理損傷，對降低青光眼發(fā)病率有效。但是，直接將4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物注射到眼中來治療青光眼目前尚不可行，仍需要進一步研究改進。

寧夏枸杞是一種富含枸杞多糖的傳統(tǒng)中藥，經(jīng)歷了長期的抗衰老效果驗證。許多前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元有潛在神經(jīng)保護作用[26-27]。Mi等[28]建造急性高眼壓動物模型，分別給予不同組動物含枸杞多糖飲食及普通飲食，觀察枸杞多糖對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和血-視網(wǎng)膜屏障的神經(jīng)保護作用。通過數(shù)據(jù)評估發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖對高眼壓引起的神經(jīng)缺血性損傷有保護作用，其保護機制與視網(wǎng)膜中下調(diào)的RAGE、內(nèi)皮素-1、Aβ(1-42)和AGEs有關(guān)，并且枸杞多糖激活的信號通路也能抑制血管損傷和神經(jīng)退行性病變。枸杞多糖還能下調(diào)AGEs表達，在非高眼壓對照組視網(wǎng)膜中，在血管周圍發(fā)現(xiàn)了AGE免疫反應(yīng)陽性表達；在普通飲食干預(yù)的高眼壓組，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層神經(jīng)中AGEs表達呈強陽性，并且內(nèi)叢狀層中的Müller細(xì)胞中AGEs表達與終足細(xì)胞有關(guān)，甚至其他視網(wǎng)膜層實質(zhì)中分布也存在一些無形態(tài)彌漫性陽性信號；在枸杞多糖喂養(yǎng)的高眼壓組中，與普通飲食喂養(yǎng)的高眼壓對照組中，AGEs表達下調(diào)。但是，在終足細(xì)胞和Müller細(xì)胞中仍有一些強陽性信號。通過上文可以推論出，枸杞多糖可以嘗試應(yīng)用到青光眼治療中。目前研究證明枸杞多糖可以抑制缺血性損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)元和血視網(wǎng)膜屏障的損傷，通過這種血管保護機制，枸杞多糖也可以是血管相關(guān)視網(wǎng)膜病變的潛在治療方案。

既往研究[29-32]認(rèn)為限制飲食中過多的糖可以優(yōu)化血糖水平，并且抑制AGEs的形成和有關(guān)眼部疾病的病理發(fā)展。最近，一些新的文獻一致認(rèn)為低含糖量飲食是有益的[33]。同樣熱量的食物，低糖指數(shù)的食物能更緩慢地釋放葡萄糖到血液中。比如蔬菜和全麥?zhǔn)澄锵毡容^緩慢，并且能緩慢釋放葡萄糖到血液中，而白面包和精制糖很快就被消化吸收掉，并且迅速轉(zhuǎn)化成血糖吸收進入血液[2]。這些結(jié)論與前文所述非酶糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物數(shù)量與體內(nèi)還原糖數(shù)量成正相關(guān)相吻合，如果降低體內(nèi)葡萄糖等還原糖濃度，中間產(chǎn)物數(shù)量也會隨之下降，AGEs的數(shù)量也會減少。

Stitt[34]認(rèn)為在不可逆的AGEs形成之前，蛋白交聯(lián)過程需要緩慢的化學(xué)重排過程(Amadori重排)來創(chuàng)建反應(yīng)性中間產(chǎn)物，所以Amadori產(chǎn)物形成是非酶糖基化反應(yīng)的基礎(chǔ)。小親核酰肼復(fù)合物氨基胍是有效的AGEs介導(dǎo)交聯(lián)抑制物，重要的藥理學(xué)方案利用這種小親核酰肼復(fù)合物氨基胍來抑制上述重排反應(yīng)，進而抑制AGEs的產(chǎn)生。破壞清除已經(jīng)形成的AGEs也是一種治療方案。在糖尿病鼠模型中，AGEs定位在了血管基底膜和視網(wǎng)膜周細(xì)胞中。另外，AGEs受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明也可以提供細(xì)胞內(nèi)治療方案[35-36]。這些研究成果表明，通過阻斷非酶糖基化中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成不可逆產(chǎn)物的過程，可以減少AGEs產(chǎn)生，這為青光眼的治療提供了新的靶點。

5小結(jié)

青光眼是全球首位不可逆致盲疾病，在我國老年患者比重及青光眼絕對數(shù)居世界首位，AGEs作為一種非酶糖基化產(chǎn)物參與了多種全身疾病的發(fā)生。本文旨在綜述AGEs在青光眼發(fā)生發(fā)展中的作用，但AGEs發(fā)揮作用所觸發(fā)的具體信號通路目前還不清楚，仍需進一步討論研究。研究AGEs在青光眼發(fā)病機制中的作用能更好、更深入研究青光眼的病因，進而更好地預(yù)防及治療青光眼，保護視功能，提高生活質(zhì)量。