算盤子提取物治療大腸桿菌性腹膜炎的機(jī)制研究

胡明燁 王長(zhǎng)娜 武春曉 周程艷 余穎聰

大腸桿菌性腹膜炎是最常見(jiàn)的細(xì)菌性腹膜炎(bacterial peritonitis，BP)，是由腸道菌群紊亂位移造成的腹腔急性、感染性炎癥，出現(xiàn)腹腔感染后，腸袢及大網(wǎng)膜通過(guò)粘連局限炎癥的蔓延，如未能及時(shí)控制感染則進(jìn)一步發(fā)展形成彌漫性炎癥，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致多臟器衰竭。在其感染過(guò)程中大量激活的炎性細(xì)胞釋放多種內(nèi)源性介質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子，其中主要包括TNF-α、IL-1β、IFN-γ等，進(jìn)而引發(fā)或加重腸道屏障的破壞并發(fā)生炎性反應(yīng)，并導(dǎo)致肝臟、腎臟等重要臟器結(jié)構(gòu)及功能的損害。

算盤子為大戟科植物，具有驅(qū)風(fēng)、利濕、消腫散瘀、抗炎鎮(zhèn)痛等藥用功效；對(duì)痢疾、皮炎、泄瀉、急性胃腸炎等有很好的治療效果，早在《江西民間草藥》中便有算盤子抗菌治療腸炎的記錄。藥理研究發(fā)現(xiàn)，該屬植物有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等作用[1]。本研究根據(jù)大腸桿菌性腹膜炎的誘發(fā)機(jī)制及算盤子的成分、功效、藥理作用，對(duì)算盤子進(jìn)行抑菌、抗炎實(shí)驗(yàn)，旨在觀察算盤子對(duì)大腸桿菌腹膜炎的治療效果并探索其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供相關(guān)的依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株：SPF級(jí)昆明種小鼠50只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量20±2g，由北京維通利華生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0002。大腸桿菌bio-00021(批號(hào)44102-3a15)、金黃色葡萄球菌bio-00002(批號(hào)26001-26)均購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

2.試劑、材料與儀器：SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH試劑盒(批號(hào)20160929)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，IFN-γ ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào)均為20180104)購(gòu)自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，CRP、MMP9、NF-κB抗體(批號(hào)均為20170428)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，算盤子采自廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣天平鎮(zhèn)新陶村自然晾干后保存，Microm HM 325 scientific型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Synergy HT型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。

3.算盤子提取物制備：取算盤子葉粉末加入蒸餾水圓底燒瓶回流2h，連續(xù)2次，合并2次提取液，向提取液中依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，將4次萃取液及萃取后水相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，備用。

4.紙片擴(kuò)散法測(cè)抑菌活性：將不同極性溶劑提取得到的恒重物配置成濃度分別為0.0170、0.0150、0.0150、0.0156、0.0147g/ml的溶液。取各溶液15μl于6mm的圓濾紙片上并烘干，后將浸過(guò)不同樣品的濾紙片分別放置在涂有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h后用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，以確定樣品抑菌活性[2]。

5.倍比稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：液體倍比稀釋法測(cè)定MIC，用蒸餾水將不同提取物配置成濃度均為0.0150g/ml的溶液。取96孔板倍比稀釋后取15μl各稀釋度的樣品溶液于長(zhǎng)有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)皿上37℃培養(yǎng)16h。以能夠抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為該樣品的MIC值。

6.實(shí)驗(yàn)分組、造模與給藥：將50只小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、小檗堿陽(yáng)性組(0.0774g/ml)、乙酸乙酯提取物高、低劑量組(0.1548、0.0774g/ml)，每組10只。陽(yáng)性組、高、低劑量組按照1ml/100g的藥量灌胃給藥，每日2次，連續(xù)5天，其余組按比例灌0.9%NaCl注射液。除正常組外其余各組小鼠均注射1ml濃度為1.5×106CFU/ml的大腸桿菌，每日1次，連續(xù)兩天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血清于-80℃貯存?zhèn)溆茫煌瑫r(shí)將肝臟、腎臟、小腸組織保存于10%甲醛溶液中備用。

7.血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β及MDA、SOD、GSH含量檢測(cè)：取上述血清，具體按照ELISA試劑盒和酶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β炎性因子的含量及MDA、SOD、GSH的含量。

8.組織形態(tài)學(xué)觀察：取上述肝臟、腎組織、小腸組織經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片，在100倍光鏡下觀察各組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

9.小腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：運(yùn)用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè)。將上述切片烤片、脫蠟、修復(fù)抗原，分別滴加NF-κB、MMP-9、CRP一抗(1∶200)，孵育、顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片。用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定鏡下陽(yáng)性染色部位的累積吸光度(A)，以表示蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.濾紙片法測(cè)抑菌活性：培養(yǎng)16h后通過(guò)直接觀察菌落生長(zhǎng)及測(cè)量抑菌圈直徑(圖1、表1)可知，算盤子提取物對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有抑制效果，但不同極性萃取物的抑菌效果有明顯差距。其對(duì)大腸桿菌抑菌效果依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層，石油醚層和蒸餾水層無(wú)明顯抑菌效果；對(duì)金黃色葡萄球菌效果依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層、蒸餾水層，石油醚層無(wú)明顯抑菌效果。

圖1 提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果A.石油醚層;B.二氯甲烷層;C.乙酸乙酯層;D.正丁醇層;E.蒸餾水層

表1 不同萃取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.倍比稀釋法測(cè)定MIC：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板倍比稀釋測(cè)得MIC值，乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.88、7.50、15.00mg/ml;對(duì)大腸桿菌的MIC分別為1.88、7.50、15.00mg/ml,詳見(jiàn)表2。

表2 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最低抑菌濃度

濃度1代表藥液的原始濃度(乙酸乙酯為0.015g/ml、正丁醇為0.015g/ml、二氯甲烷為0.015g/ml)，其余濃度隨序號(hào)增加二倍遞減；-.無(wú)菌生長(zhǎng)；+.菌體較少；++.菌體較多

3.算盤子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量水平的影響：與正常組比較，模型組SOD、GSH水平顯著降低(t=12.907，P<0.01；t=14.051，P<0.01)，MDA水平顯著升高(t=-14.406，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性組SOD、GSH水平明顯升高(t=-4.914，P<0.05；t=-9.161，P<0.05)，MDA水平顯著下降(t=7.060，P<0.01)。與模型組比較，高、低劑量組SOD水平明顯升高(t=-7.688，P<0.01；t=-3.528，P<0.05)，GSH水平明顯升高(t=-8.285，P<0.05；t=-5.415，P<0.01)，MDA水平顯著下降(t=12.959，P<0.01；t=-4.573，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表3。

4.乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá)含量的影響：與正常組比較，模型組TNF-α、 IL-1β水平顯著升高(t=-12.487，

表3 算盤子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量的影響

與正常組比較，*P<0．01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0．01

P<0.01；t=-14.136，P<0.01)，IFN-γ水平顯著降低(t=9.869，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性組TNF-α、IL-1β水平顯著降低(t=8.827，P<0.01；t=7.633，P<0.01)，IFN-γ水平顯著提高(t=-6.449，P<0.01)，與模型組比較，高、低劑量組TNF-α水平顯著降低(t=7.677，P<0.01；t=4.534，P<0.05)，IL-1β水平顯著降低(t=9.369，P<0.05；t=4.813，P<0.05)，IFN-γ水平顯著提高(t=-6.848，P<0.05；t=-5.366，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表4。

表4 算盤子提取物對(duì)小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達(dá)的影響

與正常組比較，*P<0．01；與模型組比較，#P<0．05，##P<0．01

5.小腸、肝臟、腎組織病理結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)，正常組小鼠腸黏膜完整，絨毛排列整齊。模型組腸黏膜厚度增加，細(xì)胞排列紊亂，腸絨毛形狀改變及破壞，出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組腸黏膜紊亂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，陽(yáng)性組與低劑量組得到不同程度的改善。正常組小鼠肝竇排列整齊，模型組有明顯的肝竇充血，肝竇細(xì)胞紊亂，出現(xiàn)廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組肝竇細(xì)胞較為整齊，盡有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，陽(yáng)性組與低劑量組有輕微的改善。正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，形狀規(guī)則。模型組腎小球出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞及明顯萎縮。高劑量組與陽(yáng)性組腎小球結(jié)構(gòu)完整，萎縮程度較輕。低劑量組腎小球結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕度破壞及萎縮。通過(guò)上述可知，大腸桿菌腹腔感染可對(duì)小鼠小腸、肝臟、腎組織造成損傷，算盤子具有保護(hù)、修復(fù)組織損傷的作用，詳見(jiàn)圖2。

6.乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠小腸組織局部NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表達(dá)水平的影響：與正常組比較，模型組NF-κB、MMP-9、CRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著提高(t=-22.008，P<0.01；t=-19.273，P<0.01；t=-15.194，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，陽(yáng)性組NF-κB、MMP-9、CRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(t=13.538，P<0.05；t=6.021，P<0.05；t=7.778，P<0.05)，與模型組比較，高、低劑量組NF-κB表達(dá)顯著降低(t=16.132，P<0.01；t=4.365，P<0.05)，MMP-9表達(dá)顯著降低(t=14.862，P<0.01；t=5.033，P<0.05)，CRP表達(dá)顯著降低(t=13.203，P<0.01；t=5.847，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表5、圖3。

表5 小鼠小腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP累積吸光度

與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

大腸桿菌性腹膜炎是臨床常見(jiàn)的感染性炎癥，其主要由腸道菌群移位誘發(fā)機(jī)體發(fā)生炎癥，生成大量自由基，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使對(duì)活性氧簇ROS清除能力下降，并導(dǎo)致腸道功能紊亂[3]。如感染未能控制可加重腸道黏膜的破壞和功能紊亂，并損傷周邊組織器官，促發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征。天然藥物算盤子含有黃酮類物質(zhì)、沒(méi)食子酸及槲皮素等抗菌抗炎成分[4]。本研究根據(jù)臨床疾病常見(jiàn)病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)算盤子進(jìn)行不同極性組分的抑菌實(shí)驗(yàn)，模擬藥物在體內(nèi)的抑菌作用。結(jié)果顯示算盤子的乙酸乙酯提取物能夠相對(duì)更有效地抑制菌群生長(zhǎng)，故取乙酸乙酯提取物進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 各組小鼠小腸、肝臟、腎組織切片HE染色圖(×100)A.正常組;B.模型組;C.陽(yáng)性組;D.高劑量組;E.低劑量組；Ⅰ.小腸組織;Ⅱ.肝臟組織；Ⅲ.腎組織

圖3 小鼠腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP的表達(dá)水平(HE,×100)A.正常組；B.模型組；C.陽(yáng)性組；D.高劑量組；E.低劑量組；Ⅰ.NF-κB；Ⅱ.MMP-9；Ⅲ.CRP

通過(guò)小鼠腹腔注射大腸桿菌模擬疾病模型進(jìn)行算盤子乙酸乙酯提取物體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，腹腔注射大腸桿菌能夠引起小鼠腹腔細(xì)菌性感染及腸道黏膜損傷，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，生成大量自由基導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)對(duì)肝臟、腎臟重要器官也會(huì)造成影響。主要炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ是由單核-吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞等分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。其中TNF-α具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，可以介導(dǎo)多種炎性因子釋放，參與感染和組織修復(fù)等多種病理生理過(guò)程[5]。IL-1β是由巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌的炎性細(xì)胞因子，能促進(jìn)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，引起炎性反應(yīng)和組織損傷[6]。IFN-γ作為一種重要的促炎因子，可引起腸黏膜屏障損傷[7]。MMP-9是由炎性細(xì)胞分泌的重要的蛋白水解酶，其表達(dá)與細(xì)胞炎癥密切相關(guān)。CRP是非特異性反應(yīng)中最主要、最敏感的標(biāo)志物之一，具有激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬細(xì)胞的活性、刺激單核細(xì)胞表面的組織因子表達(dá)的功能，其水平與炎性反應(yīng)及組織損傷密切相關(guān)[8]。組織病理切片顯示感染后出現(xiàn)腸道炎癥的發(fā)生和對(duì)黏膜的破壞，并對(duì)腹腔重要器官肝臟、腎臟產(chǎn)生炎性損傷。

氧化應(yīng)激狀態(tài)也是組織損傷的主要原因，SOD水平的高低反映內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的強(qiáng)弱[9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[10]。GSH 作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)代謝劑和抗氧化劑，具有清除氧自由基、增強(qiáng)抗氧化物酶活性、提高抗氧化防御能力[11]。NF-κB是一種調(diào)控因子，可同時(shí)參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)，其活化后可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β的表達(dá)增強(qiáng)，從而使炎性反應(yīng)加劇[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示算盤子乙酸乙酯提取物治療后小鼠血清中SOD、GSH與IFN-γ的含量明顯升高，而MDA、TNF-α及IL-1β的含量下降，腸組織NF-κB、CRP、MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低，且具有劑量依賴性。提示當(dāng)大腸桿菌腹腔感染發(fā)生后產(chǎn)生炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使TNF-α、IL-1β含量升高，IFN-γ含量降低，誘導(dǎo)NF-κB、MMP-9、CRP蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷。算盤子乙酸乙酯提取物能有效地調(diào)控炎性因子及氧自由基的含量，使SOD、MDA、GSH三者維持正常水平[13]。同時(shí)抑制NF-κB、CRP、MMP-9等蛋白的表達(dá)，減輕腸道過(guò)度炎性反應(yīng)及組織器官的氧化應(yīng)激作用，有效地抑制瀑布式炎性反應(yīng)，從而達(dá)到抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，算盤子乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌性腹膜炎具有一定的治療效果，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑菌、抗炎、抗氧化應(yīng)激作用實(shí)現(xiàn)的。