四神丸對脾腎陽虛型IBS-D大鼠結(jié)腸CRF表達的影響

藺曉源，鄧 娜，龍紅萍，夏旭婷，蔡 瑩，劉富林*

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）以反復發(fā)作的腹痛、腹瀉為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“泄瀉”的范疇[1]。IBS-D的發(fā)病機制尚不明確，至今亦無最佳治療方案，雖然不會嚴重威脅人體生命，但其癥狀遷延反復，對患者生活質(zhì)量的影響遠比器質(zhì)性疾病更嚴重[2]。目前一致認為，腦腸軸調(diào)控紊亂在IBS-D的發(fā)病中起主要作用。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）是腦腸軸在應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中重要的腦腸肽，CRF及其受體在胃腸道中廣泛分布，并在IBS-D的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[3]。四神丸是主治脾腎陽虛泄瀉的經(jīng)典名方，臨床用于治療IBS-D效果顯著[4-5]。為了進一步明確四神丸發(fā)揮療效的作用靶點，本研究觀察了其對脾腎陽虛型IBS-D模型大鼠CRF的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 SD大鼠40只，SPF級，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房，飼養(yǎng)溫度 21～25 ℃，濕度50%～70%。所有大鼠自由飲水、進食，每2天更換1次墊料。

四神丸[北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司，國藥準字Z13020656]，研碎后過篩，用蒸餾水配制，濃縮成0.732 g/mL濃度混懸液。得舒特（匹維溴銨片，法國蘇威制藥公司，注冊證號H20120127），研碎后過篩，配制成1.523 mg/mL藥液。番瀉葉（購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥藥房，符合2015版《中國藥典》標準）按100 g加沸水400 mL的比例，先浸泡30 min，再煮10 min，去滓，濃縮成1.0 g/mL水煎液。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠CRF ELISA試劑盒（RD公司），CRF兔抗多克隆抗體（abcam），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Bio-Swamp），蛋白質(zhì)Marker(Thermo)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA），PCR試劑盒（KAPA Biosystems）。Enspire多功能酶標儀（Perkinelmer），Z32HK高速冷凍離心機（Hermle），RM2235石蠟切片機（Leica），IX71顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯），Realplex2熒光定量PCR儀（Eppendorf），Mini Protean tetra cell蛋白印記系統(tǒng)、T100梯度PCR擴增儀、CheemiDoc XRS+Imager化學發(fā)光系統(tǒng)（美國BIO-RAD）。

1.3 動物分組與模型制備 將40只大鼠先按體質(zhì)量用隨機數(shù)字法分為2組，空白組（10只）和造模組（30只）。造模組參考文獻[6-7]方法采用番瀉葉灌胃+避水應(yīng)激方法建立脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型：造模動物給予番瀉葉水煎液灌胃（10 mL/kg），每天1次，連續(xù)28天后開始進行避水應(yīng)激；取一透明玻璃水槽（60 cm長×30 cm寬×40 cm高），中央有一島樣小平臺（10 cm長×10 cm寬×10 cm高），水槽內(nèi)注滿水，距平臺面下1 cm，每天上午9:00 — 11:00將造模大鼠置于平臺上，每天1 h，連續(xù)10 d。待模型復制成功后再將造模組隨機分為3組，分別為模型組、得舒特組和四神丸組，每組10只。

1.4 給藥方法與標本取材 四神丸組大鼠每日按7.32 g/（kg·d）劑量灌胃（相當于成人等效劑量的4倍，課題組前期研究結(jié)果已證實4倍劑量效果最優(yōu)），得舒特組按15.23 mg/（kg·d）劑量（成人等效劑量）給予得舒特水溶液，模型組給予等容量蒸餾水，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。灌胃體積量均為10 mL/kg，給藥14 d。

大鼠在最后1次灌胃后水合氯醛麻醉，冰盒上心臟采血，靜置20 min離心，取上層血清入-20℃冰箱保存；剖開腹腔剪取距離肛門10 cm處的末端結(jié)腸，其中一小段用生理鹽水漂洗后裝入凍存管中置-80℃冰箱中保存，另一小段放入多聚甲醛中固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 ELISA 檢測血清CRF的含量變化 依次按ELISA試劑盒所提供的方法，進行標準品的稀釋與加樣、溫育30 min，20倍蒸餾水稀釋濃縮洗滌液、洗滌，加入酶標試劑50 uL，再次溫育、洗滌，后加入顯色劑A、B各50 uL顯色15 min，中止液中止，酶標儀450 nm波長測量各孔的OD值。建立標準曲線的直線回歸方程式，計算出樣品濃度。

1.5.2 免疫組化法檢測結(jié)腸組織CRF的陽性表達 每組隨機取出5個標本，流水沖洗，不同濃度的乙醇逐級脫水，置入純乙醇和二甲苯的等體積混合液中透明，石蠟包埋切片，一抗（CRF抗體）孵育，maxvision二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，透明、封片。使用400倍鏡選取陽性表達不重復的5個視野拍片，最后用圖像分析系統(tǒng)分析CRF陽性染色的平均OD值。

1.5.3 Western Blot檢測結(jié)腸組織CRF的蛋白表達 每組隨機取出5個標本，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液提取蛋白，使用酶標法進行蛋白定量，制備SDS-PAGE膠，每孔上樣10 ug蛋白，經(jīng)電泳、濕轉(zhuǎn)膜、5 %脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗（CRF抗體) 室溫孵育1 h、1:10000稀釋HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，顯色后將膜置于化學發(fā)光系統(tǒng)中檢測。

1.5.4 RT-PCR檢測結(jié)腸組織CRF的mRNA 表達 每組隨機取出3個標本，根據(jù)RT-PCR的操作方法進行組織總RNA的提取、cDNA 第一條鏈的合成（總RNA中DNA的消除；總RNA中DNase1 的消除；反轉(zhuǎn)錄：42 ℃，60 min；70 ℃，15 min；16 ℃，hold）和PCR擴增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列：CRF-F：TGGATCTCACCTTCCACCTTCTG，CRF-R：CCGATAATCTCCATCAGTTTCCTG；GAPDH-F：CCTTCCGTGTTCCTAC，GAPDH-R：GACAACCTGGTCCTCA。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間的比較滿足正態(tài)性檢驗后，方差齊時采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane’s T2 法。不滿足正態(tài)性分布的采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四神丸對模型大鼠血清中CRF水平的影響 空白組、模型組、得舒特組和四神丸組血清中CRF含量分別為（81.39±9.46）ng/L、（117.07±11.24）ng/L、（93.55±9.82）ng/L、（87.40±8.73）ng/L。與空白組比較，模型組血清CRF含量增高（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組血清CRF含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 四神丸對模型大鼠結(jié)腸組織中CRF陽性表達的影響 CRF在結(jié)腸中的免疫陽性表達以胞膜和胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒染色。與空白組比較，模型組結(jié)腸CRF的陽性表達增加（P＜0.01）；四神丸組和得舒特組結(jié)腸CRF的陽性表達均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1，圖1。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織CRF表達比較（±s，n=5）

表1 各組大鼠結(jié)腸組織CRF表達比較（±s，n=5）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與得舒特組比較，▲P＜0.05

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織CRF免疫組化染色結(jié)果（×400）

2.3 四神丸對模型大鼠結(jié)腸組織中CRF蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組結(jié)腸CRF的蛋白表達升高（P＜0.01）；四神丸組和得舒特組結(jié)腸CRF的蛋白表達均明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且四神丸組低于得舒特組（P＜0.05）。見表1、圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸CRF蛋白免疫印跡電泳圖

2.4 四神丸對模型大鼠結(jié)腸組織中CRFmRNA表達的影響 見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸CRFmRNA表達柱狀圖

3 討論

IBS-D是一種與個體心理狀態(tài)有關(guān)的慢性心身疾病[8]，腦腸軸調(diào)控障礙在IBS-D的發(fā)病中起著非常重要的作用，通過兼具神經(jīng)遞質(zhì)與內(nèi)分泌激素雙重身份的腦腸肽在外周和中樞水平形成一個協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體，調(diào)節(jié)著胃腸運動、感覺、分泌等復雜功能[9-10]。IBS-D大鼠結(jié)腸CRF的含量、陽性表達及其mRNA表達升高，可能是IBS-D結(jié)腸運動異常和內(nèi)臟高敏感性的作用機制之一[11]。因此，CRF是導致IBS-D發(fā)生的重要效應(yīng)因子，其在應(yīng)激誘發(fā)的腸道動力改變中起關(guān)鍵作用。

泄瀉病位在腸，脾失健運是其關(guān)鍵，同時與腎臟密切相關(guān)[12]。《靈樞·邪氣臟腑病形》曰：“腎脈小甚為洞泄”。在此認識的基礎(chǔ)上，后世提出了脾腎陽虛的五更泄瀉。我們通過研究泄瀉的中醫(yī)證型及其證候分布規(guī)律表明，脾腎陽虛證在泄瀉中的證型比例為9.21%[13]?；凇捌⒛I相關(guān)”理論，治當益火補土?！秲?nèi)科摘要》所載四神丸為治療脾腎陽虛型泄瀉的經(jīng)典名方。方中重用補骨脂為君，溫腎助陽，壯火益土，暖脾止瀉；臣以肉豆蔻溫中澀腸；佐以吳茱萸助陽止瀉，五味子收斂固澀。本方配伍精，藥味少，藥力專，應(yīng)用廣。眾多研究報道，四神丸臨床用于治療IBS-D效果顯著，我們的Meta分析結(jié)果也表明，四神丸治療IBS-D臨床有效率優(yōu)于西藥組，且四神丸安全性更高[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，四神丸對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的作用機制可能與調(diào)節(jié)腦腸肽Ghrelin信號通路指標的表達有關(guān)[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中CRF的含量升高，結(jié)腸組織CRF的陽性表達，及其蛋白和mRNA的表達均較空白組正常大鼠升高，說明應(yīng)激致IBS-D大鼠出現(xiàn)CRF的水平紊亂。經(jīng)給藥治療后，四神丸組大鼠血清中CRF的含量降低，結(jié)腸組織CRF的陽性表達減少，CRF的蛋白和mRNA表達降低，與模型組比較均有統(tǒng)計學差異，說明四神丸能明顯調(diào)節(jié)IBS-D大鼠CRF水平。四神丸組結(jié)腸CRF的蛋白表達明顯低于得舒特組，說明具有多靶點調(diào)節(jié)作用的四神丸對CRF的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于西藥。以上研究結(jié)果表明，四神丸對脾腎陽虛型IBS-D大鼠的作用可能與降低CRF的水平和表達有關(guān)，這可能是其治療IBS-D的作用靶點之一。