SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

馬國明 左衛(wèi)微 梁磊 賈純亮 張磊 劉遠(yuǎn)廷 李景武 趙輝

胃癌是一種常見的惡性胃腸道腫瘤，近年來，盡管對(duì)胃癌的診斷和治療取得了很大的進(jìn)步，但胃癌患者5年總生存率仍然較低[1-3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組織學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用可使研究人員發(fā)現(xiàn)和鑒定出一些可用于腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療的生物標(biāo)志物。平滑肌蛋白22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與胃癌發(fā)生有關(guān)的分子標(biāo)志物[4]。SM22α是一種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，可通過與細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞骨架構(gòu)成并調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮功能。此外，SM22α還可能在細(xì)胞分化、遷移、侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)等過程中發(fā)揮重要作用[5,6]。研究表明，SM22α可以通過促進(jìn)MMP-2的表達(dá)從而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7]，在胰腺癌、食管癌、大腸癌等多種腫瘤組織中，SM22α均有不同程度的上調(diào)[8-10]。通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，Huang等[4，11]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SM22α的表達(dá)明顯高于正常癌旁組織。然而其表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制目前尚不明確。DNA甲基化在調(diào)控真核細(xì)胞基因表達(dá)方面起重要作用，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化可引起染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子無法與其DNA上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[12]。本研究檢測胃癌組織及正常癌旁組織中SM22α基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及mRNA的表達(dá)情況，探討它們的相關(guān)性及與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年10月我院胃癌患者56例的癌組織及相應(yīng)正常癌旁組織標(biāo)本(距癌組織>6 cm)；其中男35例，女21例；年齡39～76歲，中位年齡58歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療治療，所取標(biāo)本均經(jīng)過術(shù)后病理證實(shí)。標(biāo)本在離體后30 min內(nèi)采集，迅速放入裝有RNAlater液的凍存管里并浸泡，于4℃冰箱里過夜后轉(zhuǎn)置于-20℃冰箱里低溫保存?zhèn)溆?。?biāo)本和資料收集均由患者本人及家屬知情同意，并獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；EZ DNA Methylation-Gold試劑盒(美國Zymo Research公司)；PCR反應(yīng)試劑盒(美國Promega公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；RevertAid cDNA 合成試劑盒(美國Promega公司)；qPCR反應(yīng)試劑盒(上海凱杰生物技術(shù)有限公司)；引物合成(上海生工公司)；熒光定量PCR儀(7500 型)為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA提取及甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP):應(yīng)用DNA提取試劑盒提取組織DNA。應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒將DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。SM22α甲基化引物：上游引物 5’-AAT AGT GAA GTA GGA GTA GTC GTA AGT TC-3’，下游引物 5’-AAT CTA CCG AAA CTA CCG AAA C-3’；SM22α非甲基化引物：上游引物 5’-GAA TAG TGA AGT AGG AGT AGT TGT AAG TTT-3’，下游引物 5’-CAA TCT ACC AAA ACT ACC AAA AC-3’。將亞硫酸氫鹽修飾的每個(gè)組織標(biāo)本DNA進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增(一次SM22α甲基化引物擴(kuò)增；另一次SM22α非甲基化引物擴(kuò)增)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下攝影成像并保存結(jié)果。陽性對(duì)照及陰性對(duì)照：以甲基轉(zhuǎn)移酶處理后的正常人外周血DNA為模板，通過上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為甲基化陽性對(duì)照；無菌去離子水代替模板 DNA 所得的PCR產(chǎn)物為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：由SM22α甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，SM22α非甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶者為完全甲基化；由SM22α非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，而SM22α甲基化引物無目的條帶者為非甲基化；SM22α甲基化引物和非甲基化引物均擴(kuò)增出目的條帶者為部分甲基化，也記為SM22α甲基化陽性。

1.3.2 總RNA提取及qRT-PCR:應(yīng)用TRIzol試劑盒抽提組織總RNA，測定其含量和純度，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用RevertAid cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s；最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應(yīng)引物:SM22α上游引物 5’-AGG TGT GGC TGA AGA ATG GCG-3’，下游引物 5’-TCT TCG TCT ACA TAA TCC TC-3’；GAPDH作為內(nèi)參，上游引物 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。 根據(jù)樣品的Ct值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算獲得mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)副孔，取3次結(jié)果平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SM22α在胃癌組織和正常癌旁組織中甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)情況 56個(gè)胃癌組織標(biāo)本中，有16個(gè)標(biāo)本檢測到SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，甲基化率為28.6%；而正常癌旁組織中檢測到29個(gè)，甲基化率為51.8%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.278，P=0.012)。SM22α基因mRNA在胃癌組織中的平均表達(dá)量為(1.43±0.53)，在正常癌旁組織中的平均表達(dá)量為(0.85±0.34)。胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達(dá)量顯著高于正常癌旁組織(t=-5.728，P<0.01)。見圖1。

圖1 不同組織標(biāo)本的甲基化檢測，M甲基化條帶，U非甲基化條帶

2.2 甲基化陽性和陰性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達(dá)情況 SM22α基因mRNA在甲基化陽性胃癌組織中的平均表達(dá)量為(1.16±0.41)，在甲基化陰性胃癌組織中的平均表達(dá)量為(1.54±0.55)。甲基化陽性組織中mRNA的平均表達(dá)量明顯低于甲基化陰性組織(t=2.513，P=0.015)。

2.3 SM22α基因甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.013)，而與患者的年齡、性別、分化、分期及腫瘤大小無顯著相關(guān)性(P>0.05)。胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達(dá)量同樣與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.036)，而與其他病理參數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 SM22α基因甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

本研究比較胃癌患者癌組織和正常癌旁組織SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，mRNA表達(dá)水平顯著高于正常癌旁組織，且甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達(dá)量顯著低于甲基化陰性的胃癌組織。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)水平與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

SM22α最先在平滑肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后來在一些上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)也有表達(dá)[13,14]。SM22α通過和細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合，在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)及維持細(xì)胞分化表型等方面發(fā)揮重要作用。近期的一些研究表明SM22α在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，如在胰腺癌、食管癌、大腸癌等癌組織中均有不同程度表達(dá)上調(diào)[8-10]。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)SM22α表達(dá)升高可以增加大腸癌細(xì)胞的侵襲能力。在胰腺癌細(xì)胞株中，SM22α的過表達(dá)可提高胰腺癌細(xì)胞株增殖能力，增加侵襲和轉(zhuǎn)移能力[8]。Huang等[4，11]通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)均發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SM22α的表達(dá)明顯高于正常癌旁組織，本結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，胃癌組織中SM22α基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常癌旁組織，且臨床病理參數(shù)分析顯示SM22α的表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明 SM22α基因的高表達(dá)可能增加胃癌細(xì)胞的侵襲能力，在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。然而SM22α在胃癌組織中表達(dá)異常的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在調(diào)控組織特異性基因表達(dá)等方面起重要的作用。Yamamura等[16]研究表明平滑肌細(xì)胞中SM22α的表達(dá)水平主要由其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)來調(diào)控。在大腸癌細(xì)胞株HT29中，Zhao等[17]應(yīng)用去甲基化試劑“地西他濱”處理細(xì)胞后，SM22α的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高。此外，Sayar等[18]報(bào)道了乳腺癌組織中SM22α基因呈高甲基化狀態(tài)，且其甲基化狀態(tài)與SM22α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。本研究首次檢測了胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，且胃癌組織中SM22α基因甲基化狀態(tài)與患者淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。此外，甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達(dá)水平顯著低于甲基化陰性的胃癌組織。結(jié)果表明胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化可能通過上調(diào)其表達(dá)水平，從而增加胃癌細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織中SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率顯著低于正常癌旁組織，其mRNA表達(dá)水平顯著高于正常癌旁組織，甲基化陽性的胃癌組織中SM22α基因mRNA表達(dá)水平顯著低于甲基化陰性的胃癌組織，且SM22α甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)均與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。表明SM22α基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化導(dǎo)致其表達(dá)升高可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，有可能成為胃癌分子診斷和治療的重要靶點(diǎn)。