采用雙歧桿菌發(fā)酵迷迭香扣碗酪的工藝及抗氧化研究

馮紅霞，朱立紅，韓躍軍，馬立志，費(fèi)鵬，李建軍，常云鶴，*

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023）

扣碗酪是我國(guó)傳統(tǒng)的宮廷發(fā)酵乳制品，主要利用米酒進(jìn)行發(fā)酵，不需要排乳清，因此，產(chǎn)品不但兼有乳香和酒香，二者融合，風(fēng)味獨(dú)特，而且更好的保留了乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]?？弁肜液胸S富的蛋白質(zhì)、維生素和多種礦物質(zhì)，且在發(fā)酵過程中大分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解為小分子，更利于人體消化吸收，深受消費(fèi)者的喜愛[2-3]。然而，現(xiàn)有關(guān)于扣碗酪的研究多集中在其發(fā)酵工藝中，這使得扣碗酪產(chǎn)品相對(duì)單一，不能滿足消費(fèi)者對(duì)扣碗酪產(chǎn)品多樣化的需要，此外，由于采用單一的米酒發(fā)酵，導(dǎo)致扣碗酪產(chǎn)品的發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，不利于產(chǎn)品的工業(yè)化發(fā)展[2，4]。

迷迭香（Rosmarinus officinalis），屬于雙子葉植物，唇形科，迷迭香灌木，迷迭香作為香料，具有清甜帶松木香的氣息風(fēng)味，香味濃烈，可廣泛應(yīng)用于日常食品、功能食品、香料及調(diào)味品及化工等行業(yè)，被國(guó)際公認(rèn)為第三代綠色食品添加劑[5-6]。此外，迷迭香提取物具有高效、無毒的抗氧化作用及多種生理功能，包括增強(qiáng)記憶力、鎮(zhèn)靜、安神醒腦，促進(jìn)人心腦血管的血液循環(huán)，抑菌、治療消化不良和胃痛、調(diào)理皮膚油膩、刺激頭皮的毛發(fā)重新生長(zhǎng)等[6-8]。雙歧桿菌（Bifidobacterium），是常見的發(fā)酵劑，且為人和動(dòng)物腸道菌群主要的成員之一，具有抗腫瘤、潤(rùn)腸通便、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、調(diào)節(jié)胃腸道平衡等多種生理功能，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在了發(fā)酵乳制品的研發(fā)中[9-14]?；谝陨涎芯勘尘?，可以考慮研制一款以雙歧桿菌為發(fā)酵劑，具有迷迭香風(fēng)味的扣碗酪產(chǎn)品，從而解決扣碗酪產(chǎn)品單一，發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

本研究以迷迭香和全脂乳粉為主要的原料，采用雙歧桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析迷迭香和水的料液比、雙歧桿菌干粉添加量、米酒添加量和白砂糖加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（Rosmarinus officinalis Kouwan Lao fermented by Bifidobacterium，ROKLB）感官品質(zhì)的影響，并利用正交試驗(yàn)確定該產(chǎn)品的最佳配方。在此基礎(chǔ)上，利用Fenton反應(yīng)法、鄰苯三酚自氧化法和DPPH比色法揭示迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除效果，從而評(píng)價(jià)其抗氧化能力，為開發(fā)扣碗酪新產(chǎn)品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

迷迭香（Rosmarinus officinalis）：河南省洛陽市；雙歧桿菌（Bifidobacterium）：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

白砂糖、全脂乳粉、江米、安琪酒曲：洛陽大張超市；無水乙醇：蘇州科倫化工有限公司；鄰苯三酚：山東佰仟化工有限公司；硫酸亞鐵、鄰二氮菲：濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司；DPPH、過氧化氫、氫氧化鈉：雄縣萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL124-1SCN電子天平：北京奧數(shù)儀器有限公司；LDZH-100KBS立式自動(dòng)電熱蒸汽滅菌器：青島化工儀器設(shè)備有限公司；GZX-DH-300-BS-II 43L小容量電熱恒溫干燥-培養(yǎng)兩用箱：四川奧美儀器設(shè)備有限公司；BIOBASE超凈工作臺(tái)：深圳市藍(lán)思凈化科技有限公司；JHH6A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；UPG-752分光-紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的制備

根據(jù)蔡曉琳[15]的方法制備迷迭香雙歧桿菌扣碗酪，主要工藝流程如下：江米200 g→洗凈，浸泡2 h→鍋蒸30 min→冷卻到30℃左右→加入安琪酒曲（10%）→30℃培養(yǎng)3 d→濾液→得到米酒濾液（酒精度12%）；米酒濾液、迷迭香浸提液、白糖和雙歧桿菌加入到全脂乳粉中→42℃恒溫培養(yǎng)2.5 h左右→4℃后熟12 h。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 料液比對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

按照全脂奶粉為18%計(jì)算，依次以迷迭香∶水為0.5 ∶100、1 ∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL）按照工藝流程制備樣品，根據(jù)感官評(píng)定的結(jié)果分析迷迭香∶水對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪品質(zhì)的影響。

1.3.2.2 雙歧桿菌干粉添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

按照全脂奶粉為18%計(jì)算，選取0.125%、0.2505%、0.375%、0.500%、0.625%的雙歧桿菌干粉添加量制備扣碗酪樣品，分析雙歧桿菌添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響。

1.3.2.3 米酒添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

按照全脂奶粉為18%計(jì)算，選取14%、16%、18%、20%、22%的米酒濾液（體積比）比例制備樣品，分析米酒添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響。

1.3.2.4 白砂糖添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

按照全脂奶粉為18%計(jì)算，選定1%、2%、3%、4%、5%的白砂糖添加量制備扣碗酪樣品，分析白砂糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)定的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取迷迭香水提液濃度、雙歧桿菌干粉添加量、米酒濾液添加量、白砂糖添加量4個(gè)因素進(jìn)行產(chǎn)品配方的優(yōu)化，因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.4 感官評(píng)定

對(duì)迷迭香雙歧桿菌的感官評(píng)定是從色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)和口感這4個(gè)方面來進(jìn)行分析，這4個(gè)方面占的分?jǐn)?shù)分別為：15、25、25、35分，總分為 100分，感官評(píng)分表如2所示。

表2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation form of ROKLB

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 樣品預(yù)處理

以未添加迷迭香和雙歧桿菌的傳統(tǒng)扣碗酪（A組）、只添加迷迭香（B組）、只添加雙歧桿菌（C組）的扣碗酪產(chǎn)品作為對(duì)照，分別取10 g最優(yōu)配方樣品（D組）和對(duì)照樣品，按照無水乙醇∶產(chǎn)品=1∶9體積比對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行稀釋，并將樣液混合均勻，放入離心機(jī)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為4 000 r/min，時(shí)間為10 min。離心完成后，取上清液進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。

1.3.5.2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)法[16]測(cè)定產(chǎn)品上清液對(duì)羥基自由基的清除率。具體操作為：取系列干凈試管分別加入5 mmol/L的水楊酸-乙醇（95%）2 mL、10 mmol/L的FeSO41 mL，混勻，然后再向這些試管中分別添加空白待測(cè)液1 mL、樣品待測(cè)液1 mL、去離子水1 mL，再依次加10 mmol/L的H2O22 mL、10 mmol/L的 H2O22 mL和去離子水2 mL，最后使體積至25 mL，配置好溶液后，在水浴鍋設(shè)置37℃，然后計(jì)時(shí)30 min，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值樣品反復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均[16]。依據(jù)下式計(jì)算·OH的清除率：

·OH 清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為510 nm下無待測(cè)液的吸光度值；A1為510 nm下加待測(cè)液測(cè)得的吸光度值；A2為510 nm下加待測(cè)液不加H2O2測(cè)得的吸光度值。

1.3.5.3 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)O2-自由基清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[17]測(cè)定迷迭香上清待測(cè)液對(duì)O2-的清除率。具體操作為：配pH 8.2的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，3 mmol/L的鄰苯三酚（置于25℃的水浴鍋中）及樣品待測(cè)液和空白待測(cè)液備用。取4.5 mL的Tris-HCl緩沖液和4.2 mL的去離子水，混勻后放入恒溫水浴鍋中，在25℃的條件下保存20 min，再迅速加入0.3 mL預(yù)熱過的鄰苯三酸溶液，快速搖勻，在波長(zhǎng)為325 nm處測(cè)定吸光度值，每30 s測(cè)一次，總共測(cè)10次?？瞻撞捎?0 mmol/L的HCl溶液替代鄰苯三酚溶液。依據(jù)以下公式計(jì)算O2-自由基清除率：

O2-自由基清除率/%＝[1-（Vx/V0）]×100

式中：V0為325 nm下未加待測(cè)液吸光度值變化率；Vx為325 nm下加待測(cè)液吸光度值變化率。

1.3.5.4 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用DPPH比色法[18]進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：取樣品待測(cè)液、空白待測(cè)液、0.2 mmol/L的DPPH－乙醇溶液。在測(cè)試管中依次加入體積均為2 mL的待測(cè)液和DPPH－乙醇溶液，在對(duì)照管中加入體積均為2 mL的待測(cè)液和無水乙醇，在空白管中加入體積均為2 mL的DPPH－乙醇溶液和無水乙醇。將以上混合溶液分別搖勻，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)吸光度值，按照順序記為A1、A2、A0。樣品反復(fù)測(cè) 3次，結(jié)果取平均值。依據(jù)下式計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為517 nm下待測(cè)液和DPPH乙醇溶液的吸光度值；A2為517 nm下待測(cè)液和無水乙醇的吸光度值；A0為517 nm下無水乙醇和DPPH乙醇溶液的吸光度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，利用SPSS20.0軟件中的Tukey’s檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

選取迷迭香浸提液∶水料液比為0.5∶100、1∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL），分析迷迭香浸取液濃度對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on sensory evaluation of ROKLB

由圖1中可知，迷迭香與水料液比為1∶100（g/mL）時(shí)評(píng)分最高，此時(shí)產(chǎn)品色澤均勻，風(fēng)味適中，當(dāng)迷迭香與水料液比為0.5∶100（g/mL）時(shí)產(chǎn)品色澤淡黃，迷迭香香味風(fēng)味不足，當(dāng)迷迭香與水料液比為2.5∶100（g/mL）時(shí)迷迭香香味過重，影響產(chǎn)品整體風(fēng)味。可見，迷迭香∶水的最佳料液比為1∶100（g/mL）。

2.1.2 雙歧桿菌干粉添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

選取雙歧桿菌干粉添加量為0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%，分析雙歧桿菌干粉添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響，結(jié)果如下圖2所示。

圖2 雙歧桿菌干粉添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響Fig.2 Effect of additive amount of Bifidobacterium powderon sensory evaluation of ROKLB

雙歧桿菌干粉添加量為0.375%時(shí)產(chǎn)品感官評(píng)分最高，添加量小于0.375%不利于扣碗酪的凝乳，產(chǎn)品有乳清析出的現(xiàn)象，大于0.375%產(chǎn)品的硬度較大，口感不細(xì)膩。可見雙歧桿菌干粉的最佳添加量為0.375%。

2.1.3 米酒添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

選取米酒（酒精度12%vol）添加量為14%、16%、18%、20%、22%，分析米酒添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響，結(jié)果圖3所示。

圖3 米酒添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響Fig.3 Effect ofrice wineadditive amount on sensory evaluation of ROKLB

由圖3可知，米酒添加量為18%時(shí)扣碗酪感官評(píng)分最高為88分，當(dāng)米酒添加量大于20%或者低于16%時(shí)產(chǎn)品感官評(píng)分在60分左右，此時(shí)乳清洗出嚴(yán)重?？梢娒拙频淖罴烟砑恿繛?8%。

2.1.4 白砂糖添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響

選取白砂糖添加量為1%、2%、3%、4%、5%，分析白砂糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 白砂糖添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)定的影響Fig.4 Effect of sugar additive amount on sensory evaluation of ROKLB

當(dāng)白砂糖添加量在2%時(shí)，感官評(píng)分最高為87分，說明白砂糖最佳的添加量為2%。

2.2 正交試驗(yàn)

為了得到迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的最佳組合，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，并進(jìn)行方法分析，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The orthogonal test results

由表3可知，影響迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官品質(zhì)的主次順序?yàn)椋弘p歧桿菌干粉添加量（B）＞迷迭香∶水（料液比）（A）＞米酒添加量（C）＞白砂糖添加量（D），產(chǎn)品的最優(yōu)組合為A2B1C3D2即迷迭香∶水為1∶100，雙歧桿菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。按照最優(yōu)組合制備迷迭香雙歧桿菌扣碗酪。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，產(chǎn)品的感官評(píng)定得分分別為92、92、93，平均得分為92.33，高于正交試驗(yàn)各組得分。方差分析見表4。

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Anova table of orthogonal test

由表4可知，在4個(gè)因素中，迷迭香∶水（A）、雙歧桿菌干粉添加量（B）和米酒添加量（C）對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官品質(zhì)有顯著性影響（P＜0.05）。而白砂糖添加量（D）對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)定影響為不顯著（P＞0.05）。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)·OH的清除作用

以未添加迷迭香和雙歧桿菌、只添加迷迭香、只添加雙歧桿菌的扣碗酪產(chǎn)品作為對(duì)照，分析最優(yōu)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)·OH的清除率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)·OH的清除能力Fig.5 Ability of ROKLB to clear the·OH

由圖5可知，添加了迷迭香和雙歧桿菌扣碗酪（D組）對(duì)·OH的清除能力為69.85%，顯著高于其它3組對(duì)照樣品（P＜0.05）。此外只添加迷迭香（B組）和只添加雙歧桿菌（C組）的扣碗酪樣品對(duì)·OH的清除能力也有所提高，但與空白組相比并不顯著（P＞0.05）。可見迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)·OH清除能力的顯著提高是迷迭香和雙歧桿菌協(xié)同作用的結(jié)果。

2.3.2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)O2-自由基的清除作用

取4組扣碗酪樣品（10 g），對(duì)其清除O2-自由基的能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)O2-自由基的清除能力Fig.6 Ability of ROKLB to clear the O2-radical

迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（D組）對(duì)O2-自由基的清除率為42.31%，顯著高于其他3組扣碗酪樣品（P＜0.05）。此外，單獨(dú)添加迷迭香和雙歧桿菌均可以顯著提高扣碗酪對(duì)O2-自由基的清除能力（P＜0.05），但只添加迷迭香（B組）和只添加雙歧桿菌（C組）之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)DPPH·的清除作用

以A組、B組和C組做對(duì)照組，分析迷迭香和雙歧桿菌的扣碗酪DPPH·清除能力的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 Ability of ROKLB to clear the DPPH·

迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（D組）對(duì)DPPH·的清除率為50.16%，顯著高于其他3組扣碗酪樣品（P＜0.05），說明迷迭香和雙歧桿菌的加入提高了扣碗酪對(duì)DPPH·的清除率。

3 結(jié)論

本研究利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的最優(yōu)配方，即迷迭香∶水料液比為1∶100，雙歧桿菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。其中，迷迭香∶水料液比、雙歧桿菌干粉和米酒添加量對(duì)迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評(píng)分有顯著性影響，而白砂糖添加量（D）對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)定影響不顯著。迷迭香雙歧桿菌扣碗酪抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明迷迭香和雙歧桿菌的加入顯著提高了產(chǎn)品對(duì)·OH、O2-·和DPPH的清除能力。迷迭香雙歧桿菌扣碗酪中添加了食用型香料迷迭香和對(duì)人體有益生作用的雙歧桿菌，不僅豐富了扣碗酪產(chǎn)品的種類，而且雙歧桿菌的添加可以促進(jìn)扣碗酪的凝乳，改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性，有利于扣碗酪產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。此外，迷迭香和雙歧桿菌的添加提高了扣碗酪的抗氧化活性，而抗氧化活性是多種益生功能的基礎(chǔ)，因此本研究為功能性扣碗酪產(chǎn)品的研發(fā)提供了新的思路和理論依據(jù)。