油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系1193A恢復(fù)基因SNP位點(diǎn)的TSP分析

胡燕 尹明智 冶飛碟

摘 要：油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜種是當(dāng)前油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑，而恢復(fù)基因的連鎖標(biāo)記研究對于恢復(fù)系的選育和改良至關(guān)重要。本研究基于前期研究結(jié)果設(shè)計(jì)引物對與油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系1193A恢復(fù)基因連鎖的2個SNP位點(diǎn)進(jìn)行TSP標(biāo)記分析，以期建立一種簡單高效易行的油菜雄性不育系1193A恢復(fù)基因的SNP分析方法。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的2對TSP標(biāo)記引物擴(kuò)增效果較好，可用來進(jìn)行后續(xù)的研究分析。

關(guān)鍵詞：油菜;不育系;恢復(fù)基因;SNP;TSP

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530007

油菜是我國主要的油料作物之一，具有明顯的雜種優(yōu)勢，油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）是當(dāng)前油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑，也是最重要的傳粉控制系統(tǒng)之一。油菜CMS系統(tǒng)一般包含不育系、保持系和恢復(fù)系，而不育系的應(yīng)用需選育強(qiáng)優(yōu)勢恢復(fù)系用來配制強(qiáng)優(yōu)勢雜交種，這對油菜雜種優(yōu)勢的利用是至關(guān)重要的[1]。常規(guī)的育種方式需大量雜交，育種周期長，工作量大。隨著測序技術(shù)以及生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種手段也隨之發(fā)展，其中分子標(biāo)記技術(shù)在分子育種中應(yīng)用最為廣泛。分子標(biāo)記方法不受外界環(huán)境因素的影響，對基因定位及分子育種有重要作用。SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）作為第3代分子標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于遺傳分析，是一種便于分析，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)的分子標(biāo)記[2]。SNP的檢測方法眾多，但有些技術(shù)方法較難掌握，且應(yīng)用成本較大。TSP（Temperature Switch PCR）方法，是由Tabone等[3]提出，優(yōu)點(diǎn)是只需經(jīng)過一輪PCR，就可以直接通過瓊脂糖凝膠電泳檢測SNP位點(diǎn)，方法簡便易行。目前TSP方法在大麥[4]、小麥[5]、葡萄[6]等物種的SNP位點(diǎn)檢測分析中都有了成功的應(yīng)用。

前期研究中通過屬間雜交獲得了油菜新型胞質(zhì)雄性不育系1193A[7]，并通過大量的測交發(fā)現(xiàn)了其恢復(fù)系。通過油菜60K SNP芯片，結(jié)合BSA法將恢復(fù)基因初步定位在C09染色體上，并發(fā)現(xiàn)了2個連鎖的SNP位點(diǎn)[8]，本研究將對這2個SNP位點(diǎn)進(jìn)行TSP標(biāo)記分析，以期建立一種簡單高效易行的油菜雄性不育系1193A恢復(fù)基因的SNP分析方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

不育系1193A與恢復(fù)系1193R2的種子均由國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 油菜基因組DNA的提取

利用CTAB法提取基因組總DNA。

1.3 TSP標(biāo)記檢測SNP位點(diǎn)

根據(jù)前期油菜60K SNP芯片分析的研究結(jié)果[8]，本研究對Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830 2個SNP位點(diǎn)進(jìn)行TSP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)，其引物設(shè)計(jì)原則參照Tabone等提出的原則進(jìn)行設(shè)計(jì)[3]。設(shè)計(jì)2個位點(diǎn)特異性引物和1個等位基因特異性引物，其中，位點(diǎn)特異性引物是在SNP位點(diǎn)的兩側(cè)，引物退火溫度為63℃，等位基因特異性引物在SNP位點(diǎn)上游，退火溫度為45℃，然后在5′端人工添加2～3bp的核苷酸序列[6]。

PCR反應(yīng)體系為20μL，其中包括：ddH2O 10.6μL，10×緩沖液2μL，每個引物0.2μmol/L，dNTPs 0.2μmol/L，Taq酶1U，DNA 50ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min;先94℃40s，60℃40s，72℃40s，15個循環(huán);然后94℃10s，45℃30s，5個循環(huán);最后94℃40s，54℃40s，72℃10s，15個循環(huán)。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)

針對SNP標(biāo)記分析時TSP方法設(shè)計(jì)引物的要求，對前期研究開發(fā)的位于C09染色體上的，與恢復(fù)基因連鎖的SNP位點(diǎn)Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830進(jìn)行了分析，并設(shè)計(jì)TSP標(biāo)記引物用于后續(xù)的檢測分析。

2.2 SNP位點(diǎn)TSP標(biāo)記分析結(jié)果

用3對TSP標(biāo)記引物對2個SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果顯示：有2對TSP標(biāo)記引物能擴(kuò)增出與預(yù)期長度相吻合的PCR產(chǎn)物，電泳條帶較清晰。如圖1所示，利用引物TSP1和TSP2對候選SNP位點(diǎn)A/G進(jìn)行TSP標(biāo)記分型，從電泳條帶可得出，引物TSP1檢測不育系1193A在720bp和380bp左右各有1條帶，引物TSP2檢測不育系1193A在720bp和200bp左右各有1條帶，而恢復(fù)系1193R2均是在720bp左右的1條帶，說明通過TSP1和TSP2標(biāo)記能夠檢測Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044所在的SNP位點(diǎn)差異。而設(shè)計(jì)的TSP3標(biāo)記引物對Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830處的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測沒有獲得預(yù)期的結(jié)果，可能是引物設(shè)計(jì)不合理，或PCR條件不佳造成的。

3 討論

油菜CMS系統(tǒng)有同源胞質(zhì)不育系和異源胞質(zhì)不育系。不育系1193A為屬間雜交后代選育而來的異源胞質(zhì)不育系，而這種不育系往往存在恢復(fù)源較窄的問題。為了有利于發(fā)現(xiàn)更多的恢復(fù)源材料，選育出恢復(fù)系，人們常常會將不育系與大量的材料進(jìn)行廣泛雜交，再觀察雜交后代的育性表現(xiàn)，但這樣工作量大，時間較長。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)能縮短育種周期，近幾年在作物品種育種中發(fā)揮了重要作用，日漸受到育種家的喜愛。對恢復(fù)系進(jìn)行分子標(biāo)記研究，找到與恢復(fù)基因緊密連鎖的標(biāo)記，可為恢復(fù)系的選育提供技術(shù)支撐，提高選擇效率和準(zhǔn)確性。TSP標(biāo)記引物檢測方便，成本較低，結(jié)果的可靠度也較高，只需進(jìn)行一輪PCR即可直接從電泳結(jié)果分析SNP位點(diǎn)，是AS-PCR的升級版[9]，適用于一般實(shí)驗(yàn)室開展SNP檢測。本研究設(shè)計(jì)了TSP標(biāo)記引物3對，用于檢測不育系1193A恢復(fù)基因的SNP位點(diǎn)差異，結(jié)果表明，其中2對擴(kuò)增效果較好，可用來進(jìn)行后續(xù)的研究分析。這為通過簡單易行的方式選育恢復(fù)源材料提供了技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] 程計(jì)華，李云昌，梅德圣，等.幾種農(nóng)作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的定位和分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報，2006，23（6）：613-624.

[2]Kim S，Misra A. SNP genotyping：Technologies and biomedical applications[J]. Annual Review of Biomedical Engineering，2007（9）：289-320.

[3] Tabone T，Mather D，Hayden M. Temperature Switch PCR（TSP）：Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs[J]. BMC Genomics，2009，10 （1）：580.

[4] Hayden M J，Tabone T，Mather D E.Development and assessment of simple PCR markers for SNP genotyping in barley[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119 （5）：939-951.

[5] Huang X Q，Brlé-Babel A. Sequence diversity，haplotype analysis，association mapping and functional marker development in the waxy and starch synthase IIa genes for grain-yield-related traits in hexaploid wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Mol Breeding，2012（30）：627-645.

[6]郭大龍，李猛，張國海，等.葡萄SNP標(biāo)記的CAPS和TSP分析[J].園藝學(xué)報，2013，40（11）：2307-2315.

[7]尹明智，官春云.甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系1193A的選育及分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，30（9）：1947-1953.

[8]尹明智.野油胞質(zhì)雄性不育系1193A的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[9]雷天剛，何永睿，彭愛紅，等.柑橘CAPS標(biāo)記和AS-PCR引物的開發(fā)[J].園藝學(xué)報，2012，39（6）：1027-1034.

（責(zé)任編輯 賈燦）