白玉蝸牛糖胺聚糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表征

王玭，寧子陌，時(shí)響，高娜，趙金華

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,民族藥學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430074)

糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)是一類由己糖醛酸(或己糖)和氨基己糖交替連接而成的多糖類化合物.常見的GAG有硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素(heparin, HP)、透明質(zhì)酸等.其中，肝素是由氨基葡萄糖(GlcNAc)和艾杜糖醛酸IdoA(90%)或葡萄糖醛酸(GLcA)(10%)以α1,4 糖苷鍵交替連接形成，且存在N-硫酸基，O-硫酸基以及N-乙酰化等多種結(jié)構(gòu)修飾[1]，因此其一級結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜.肝素因含有與抗凝血酶III特異性結(jié)合的特殊的戊糖序列而具有強(qiáng)效的抗凝抗血栓活性，另外，肝素還具有抑制腫瘤生成與轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、抗炎等多種生物活性[2].

上世紀(jì)90年代，Kim等[3]首次從非洲大蝸牛(Achatinafulica)體內(nèi)分離出一種新型的糖胺聚糖，是由GlcNAc與IdoA2S通過α(1→4)糖苷鍵連接的糖胺聚糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)近似肝素及硫酸乙酰肝素而更為規(guī)則，該GAG不具有抗凝血活性，而具有抗炎、抑制血管生成、抑制腫瘤生長、抑制成纖維細(xì)胞生長因子FGF-2活性等顯著的藥理活性[4].白玉蝸牛(Achatinafulica)屬柄眼目瑪瑙螺科，是非洲大蝸牛的白化亞種，是我國已大量人工養(yǎng)殖的陸生貝殼類食材，具有豐富的營養(yǎng)成分和廣泛的醫(yī)藥保健價(jià)值.本文以白玉蝸牛肉為原料，對其所含的糖胺聚糖(AFG)進(jìn)行提取純化，采用具有糖苷鍵選擇性的β-消除解聚法對AFG進(jìn)行解聚，分析AFG單糖組成和硫酸羧酸摩爾比，結(jié)合AFG及dAFG的理化性質(zhì)及波譜分析法解析其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，為闡明其構(gòu)效關(guān)系及藥理機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A，上海儀電)，紫外可見光分光光度計(jì)(UV2450，Shimadzu公司)，全自動(dòng)數(shù)字旋光儀(Autopol IV-T，美國Rudolph)，傅立葉變換中紅外光譜儀(Tracer-100，日本島津)，超導(dǎo)核磁共振儀(Advance Ⅲ 600MHz，瑞士布魯克)，高效液相色譜儀(Agilent1260，美國安捷倫).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

白玉蝸牛(Achatinafulica)，購于湖北逸鋒白玉蝸牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社.

Sephadex G10(GE, 美國)，Amberliter FPA98(Cl-)陰離子樹脂(羅門哈斯,美國)，陽離子交換樹脂[Dowex×50 W×8 100～200(H)，陶氏，美國].

堿性蛋白酶(20 萬單位/g，索萊寶)，30% H2O2、三氯甲烷、五氧化二磷、N,N-二甲基甲酰胺、氯化芐、金屬鈉(AR，國藥集團(tuán))；L-艾杜糖醛酸(IdoA，上海源葉)，L-(-)-半乳糖(Gal)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(阿拉丁)，1,9-二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)、D-葡萄糖(Glc)(Sigma)，D-半乳糖胺鹽酸鹽(GalN·HCl)、芐索氯銨(麥克林)，氨基葡萄糖(GlcN)(上海榮泰制藥).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 AFG的提取純化

取干燥白玉蝸牛肉(去內(nèi)臟)800 g粉碎，主要提取純化步驟如下[5].

酶解：加入10倍量去離子水，攪拌，50 ℃下加入堿性蛋白酶(終濃度為1%)，并緩慢加入6 mol/L NaOH保持pH在9左右，酶解24 h.

堿解：加入6 mol/L NaOH至終濃度為0.5 mol/L，50 ℃堿解2 h，冷卻至室溫，6 mol/L HCl 調(diào)pH 至中性，靜置過夜，離心去沉淀.上清加入95%食用乙醇至終濃度為60%，靜置過夜，離心得沉淀.

脫色：沉淀用5倍量去離子水溶解，加入30 % H2O2使其終濃度為3 %，pH 保持在10左右，50 ℃脫色2 h，冷卻至室溫后，6 mol/L HCl 調(diào)pH 至中性，離心去沉淀，得脫色液.

鹽析醇沉：脫色液加入95%食用乙醇以終濃度為40%和60%分級醇沉.60%醇沉的沉淀即為粗多糖.

純化：粗多糖用去離子水溶解，10 kDa超濾脫鹽后，緩慢加62.5 mg/mL 芐索氯銨溶液，攪拌，靜置過夜后離心去上清.沉淀加入等體積的飽和氯化鈉，混勻過夜，加入95%食用乙醇以終濃度為60%醇沉，離心繼續(xù)加飽和氯化鈉，此過程進(jìn)行3次，最終沉淀水溶，過濾，10 kDa超濾脫鹽.截留液濃縮后上樣于FPA98(OH-)強(qiáng)陰離子交換柱，用H2O、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、0.8 mol/L NaCl依次進(jìn)行洗脫，0.8 mol/L NaCl洗脫流份用10 kDa超濾脫鹽，凍干，得酸性多糖組分AFG.

2.2 AFG的 β-消除解聚

季銨鹽轉(zhuǎn)化：精密稱取AFG 0.1002 g，將其溶于3.5 mL去離子水中，再精密稱取芐索氯銨0.2658 g，溶于4.0 mL去離子水中.將芐索氯銨溶液緩慢加入至AFG溶液中，振蕩混勻后靜置12 h，次日離心(4700 r/min，20 min)，棄上清液得沉淀.沉淀以3.0 mL去離子水洗滌兩次后以五氧化二磷為干燥劑，在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得AFG季銨鹽0.1822 g.

羧基酯化：取1.5 mL DMF加入上述所得到的AFG季銨鹽中，使其溶解.再向其中加入60 μL氯化芐溶液，置于磁力攪拌器上，于35 ℃密閉反應(yīng)25 h，待反應(yīng)結(jié)束后降溫至25 ℃.

β-消除解聚：取0.5 mL新配制的0.16 mol/L的乙醇鈉乙醇溶液加入上述反應(yīng)溶液中，反應(yīng)30 min.將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入1.82 mL飽和氯化鈉溶液，再加入14.56 mL無水乙醇終濃度為80%(v/v)醇沉.離心(4700 r/min，10 min)，沉淀繼續(xù)交換2次，棄上清取沉淀.將上述沉淀用4.0 mL去離子水溶解，加入6.0 mol/L的NaOH溶液67.8 μL至其濃度為0.1 mol/L，在室溫下反應(yīng)30 min，用6.0 mol/L HCl中和，G10凝膠柱層析脫鹽，凍干得解聚產(chǎn)物dAFG.

2.3 AFG和dAFG的理化性質(zhì)分析

2.3.1 紫外-可見分光光度法(UV-Vis)

分別精密稱取AFG和dAFG 1 mg，配制成1 mg/mL的水溶液，在190～400 nm波長范圍進(jìn)行掃描.

2.3.2 高效凝膠色譜法(HPGPC)

分別精密稱取AFG和dAFG 1 mg，配制成1 mg/mL的水溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，進(jìn)行HPGPC分析，記錄色譜圖.色譜條件：Shodex OHpak SB-804 HQ 色譜柱；柱溫，35 ℃；流動(dòng)相為0.1 mol/L氯化鈉溶液；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為50 μL；檢測器為示差檢測器RID.

2.3.3 分子量測定

分別稱取10 mg AFG和肝素鈉，采用SEC-RI-MALLS聯(lián)用技術(shù)測定AFG的分子量及分子量分布，委托北京理化測試中心完成[6].

依次稱取系列分子量右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為10 mg/mL的0.1 mol/L NaCl 溶液，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣量為20 μL，數(shù)據(jù)采用GPC軟件處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)定分子量的AFG進(jìn)行校正，既得寬標(biāo)校正曲線.可用于dAFG的分子量及其分布檢測.

2.3.4 易染性分析

取AFG和肝素鈉各1 mg，加水溶解為1 mg/mL的溶液，各取100 μL的AFG、肝素鈉溶液和去離子水，加2 mL 1,9-二甲基亞甲藍(lán)溶液[7]，渦旋混勻2 min，掃描190～800 nm 波長范圍的紫外光譜(UV).

2.3.5 比旋光度分析

依2015 版《中國藥典》第四部通則部分所述檢測旋光度的方法，將AFG和dAFG樣品均配成濃度為1 mg/mL 的溶液，測定方法：鈉單色光源(λ 589.3 nm)，在 20 ℃下使用全自動(dòng)數(shù)字旋光儀測定其旋光度，在同一條件下檢測3次，取其平均值，得比旋光度.

2.4 AFG化學(xué)組成檢測

2.4.1 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化法分析單糖組成[8]

完全酸水解：取AFG 約1 mg，加水溶解至濃度為 2 mg/mL，取該溶液 500 μL加入 4 mL具塞試管中，加入 500 μL 4 mol/L的三氟乙酸溶液，充N2，封管，110 ℃水解4 h，取出水解液，于70 ℃水浴鍋中蒸干期間加入1 mL 甲醇以除去多余的三氟乙酸，共加3次甲醇，最后一次蒸干后，樣品加入100 μL水溶解，作為供試品溶液.

PMP衍生化：供試品溶液中加入 100 μL 0.6 mol/L 的氫氧化鈉溶液和 200 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液，渦旋混勻；70 ℃衍生化反應(yīng) 60 min；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入 200 μL 0.3 mol/L 的鹽酸溶液進(jìn)行中和，用 1 mL 三氯甲烷萃取 3 次，水相部分經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾供HPLC分析.另取單糖標(biāo)準(zhǔn)品(Glc、Gal、GlcN.HCl、GalN.HCl、IdoA)適量，加 1mL 水溶解，作為對照溶液，進(jìn)行PMP衍生化反應(yīng).

HPLC色譜條件：Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm，Agilent, USA)色譜柱；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1 M PBS(pH 6.7)-乙腈(83∶17)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm，進(jìn)樣量：20 μL.

2.5 AFG和dAFG的波譜分析

2.5.1 紅外光譜(IR)分析

取AFG及dAFG 2 mg經(jīng)40 ℃真空干燥 24 h，利用KBr壓片法壓片，傅立葉變換紅外光譜儀Tracer-100對AFG樣品進(jìn)行4000～400 cm-1掃描，記錄光譜圖.

2.5.2 核磁共振波譜(NMR)分析

分別取AFG及dAFG約5 mg，溶于 0.5 mL D2O 中，冷凍干燥，D2O 交換3次后，將樣品溶于 0.5 mL D2O中，于25 ℃下使用 Bruker Advance 600 MHz 核磁共振波譜儀檢測1H/13C NMR譜圖.

3 結(jié)果與分析

3.1 AFG的提取與純化

采用酶解-堿解處理法提取白玉蝸牛粗多糖[5]，繼而以等電點(diǎn)法除蛋白質(zhì)、過氧化氫處理脫色，繼而以醇沉處理獲得粗多糖.采用季銨鹽沉淀法和陰離子交換柱層析法對所得粗多糖(圖1a)進(jìn)行進(jìn)一步純化，獲得均一性的酸性粘多糖AFG，其HPGPC色譜圖(圖1b)呈單一色譜峰，面積歸一化法計(jì)算AFG的純度大于99 %.

圖1 白玉蝸牛粗多糖(a)、AFG(b)的HPLC圖及AFG的紫外吸收光譜(c)

AFG的紫外吸收光譜(圖1c)顯示，該糖胺聚糖僅具有210 nm處的末端吸收，在 260 nm 和 280 nm處無明顯吸收峰，表明該AFG中基本不含蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì).

3.2 AFG的β-消除解聚

β-消除解聚法可選擇性斷裂連接于糖醛酸C-4位的糖苷鍵，并在產(chǎn)物的非還原端己糖醛酸中引入Δ4,5不飽和雙鍵[10].該方法首先制備AFG的羧基芐酯化產(chǎn)物，繼而在乙醇鈉乙醇溶液中進(jìn)行β-消除解聚，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)后處理得到解聚產(chǎn)物dAFG.

HPGPC(圖2a)分析顯示，dAFG的保留時(shí)間明顯延遲，提示其分子量明顯降低；紫外吸收光譜(圖2b)分析顯示，dAFG在234 nm處有最大紫外吸收，表明解聚產(chǎn)物非還原端Δ4,5-不飽和己糖醛酸的形成，該結(jié)果與β-消除解聚法的糖苷鍵選擇性解聚特點(diǎn)相符.

圖2 dAFG的HPGPC圖(a)及紫外吸收光譜(b)

3.3 AFG和dAFG分子量檢測

采用分子排阻色譜、示差檢測器和多角度激光光散射儀聯(lián)用技術(shù)(SEC-RI-MALLS)可直接測定絕對重均分子量及分子量分布，AFG的Mw(重均分子量)為23.84 kDa，Mn(數(shù)均分子量)為21.33 kDa，分散系數(shù)Mw/Mn為1.118.AFG的分子量分布較窄，表明AFG為均一性多糖.AFG的Mw高于肝素鈉而低于非洲大蝸牛來源GAG[3](表1).

采用GPC軟件，根據(jù)系列分子量的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用已知分子量的AFG進(jìn)行寬標(biāo)校正，計(jì)算dAFG的Mw約為2.00 kDa.

表1 AFG和dAFG的分子量及理化性質(zhì)測定結(jié)果

注：n.d：未檢測

3.4 AFG和dAFG的理化性質(zhì)

3.4.1 易染性分析

酸性多糖可使1,9-二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)的最大吸收波長向低波長移動(dòng)(藍(lán)移現(xiàn)象)，此即酸性多糖的易染性.由于中性多糖不能使DMMB的最大吸收波長藍(lán)移[7]，因此，易染性特征可用于酸性多糖的鑒別.易染性分析結(jié)果(圖3)顯示，與肝素鈉一致，AFG可以使DMMB的最大吸收波長藍(lán)移至520 nm，顯示其具有酸性多糖的性質(zhì).

圖3 AFG及肝素的易染性分析紫外掃描光譜

3.4.2 比旋光度

AFG的比旋光度為+75°，為右旋光物質(zhì)；dAFG的比旋光度為+17°.文獻(xiàn)報(bào)道[11]小腸粘膜來源肝素的比旋光度為+53°，非洲大蝸牛[3]來源的GAG的比旋光度為+44°.

3.5 AFG的化學(xué)組成分析

3.5.1 單糖組成分析

PMP衍生化法分析AFG單糖組成，結(jié)果(圖4)表明，AFG由氨基葡萄糖(GlcN)和艾杜糖醛酸(IdoA)組成，與非洲大蝸牛來源的GAG相同[3].AFG的色譜圖中IdoA信號較低，可能是由于糖醛酸在完全酸水解的條件下發(fā)生了糖環(huán)斷裂，造成了破壞.

圖4 AFG單糖組成分析的HPLC圖(a, b)及其電導(dǎo)率滴定圖(c)

3.6 AFG和dAFG的波譜分析

3.6.1 紅外光譜(IR)

AFG和dAFG的紅外特征吸收峰基本一致(圖5a, b)，以AFG為例，主要有：3429 cm-1強(qiáng)吸收為O-H 的伸縮振動(dòng)，說明有糖環(huán)醇羥基的存在；2928 cm-1為糖環(huán)上亞甲基 C-H的伸縮振動(dòng)；1649 cm-1為O-H的彎曲振動(dòng)；1261 cm-1為硫酸酯基S=O伸縮振動(dòng)；1000～1028 cm-1為糖環(huán)上 C-O-C 伸縮振動(dòng)；780～810 cm-1為吡喃環(huán)骨架的振動(dòng)；1417.68 cm-1為艾杜糖醛酸羧基上的C-O 伸縮振動(dòng).

3.6.2 AFG和dAFG的核磁共振波譜

AFG的1H NMR譜圖如圖5d所示.與文獻(xiàn)報(bào)道的非洲大蝸牛來源的GAG的譜圖比較[3]，2.0 ppm處的峰為GlcNAc的甲基信號(A8)，在4.9～5.0 ppm應(yīng)為兩個(gè)糖環(huán)端基氫信號，其中4.9 ppm處為GlcNAc的端基氫(A1)，5.0 ppm處為IdoA2S的端基氫(U1)，其積分比值提示IdoA2S與GlcNAc的摩爾比為1∶1.

dAFG的1H和13C NMR如圖5e、f，與原型AFG相比，在約5.9 ppm處新出現(xiàn)了一組信號峰，根據(jù)文獻(xiàn)[3]歸屬為不飽和糖醛酸的4位H，說明在產(chǎn)物的非還原端形成了不飽和糖醛酸(圖5c)，5.4 ppm處為不飽和糖醛酸的1位H，4.9～5.2 ppm范圍內(nèi)為其他糖環(huán)上的1位氫，位于高場的1.9 ppm 左右為GlcNAc的甲基氫的信號，而在 3.5～4.0 ppm 之間的為糖環(huán)上其他質(zhì)子信號峰.根據(jù)文獻(xiàn)資料[12]，對碳信號進(jìn)行了初步歸屬，25 ppm為GlcNAc甲基碳信號，在90～105 ppm范圍內(nèi)為各個(gè)糖環(huán)上的端基碳信號，不飽和糖醛酸(ΔU)的C1峰出現(xiàn)在約99.4 ppm，C4的化學(xué)位移約為 108.6 ppm，C5的化學(xué)位移約為 147.1 ppm，176～180 ppm處為糖醛酸上的羧基碳和GlcNAc的羰基碳信號.其位于非末端的單糖的1H/13C NMR 信號與原型AFG信號特征基本一致，即除了非還原性端的結(jié)構(gòu)變化之外，β-消除解聚過程中，AFG的其他結(jié)構(gòu)可基本保持穩(wěn)定.

圖5 AFG及dAFG的IR(a, b)，1H NMR(d, e)譜圖和dAFG的13C NMR(f)譜圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)(c)

4 結(jié)語

從白玉蝸牛中分離純化了均一的酸性多糖AFG，得率為0.88%，其Mw為23.84kDa，通過理化分析及波譜檢測可以判斷，AFG是由等摩爾的氨基葡萄糖GlcNAc和2位硫酸酯基取代的艾杜糖醛酸(IdoA2S)通過α(1→4)糖苷鍵交替連接而成，與非洲大蝸牛來源GAG結(jié)構(gòu)基本一致.與哺乳動(dòng)物來源的肝素和硫酸乙酰肝素相比，AFG的結(jié)構(gòu)相對規(guī)則.糖苷鍵選擇性的β-消除解聚法解聚顯示，除糖苷鍵裂解外，其他基本結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其確切結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步通過純化寡糖確證，即利用bottom-up策略研究AFG的確切結(jié)構(gòu).

在藥理學(xué)活性研究方面，與肝素對比，AFG不存在特異性結(jié)合AT的五糖序列，故在高濃度下不具有抗凝活性[4, 5].He等[13]報(bào)道非洲大蝸牛和黃蛞蝓來源的GAG均具有較強(qiáng)的乙酰肝素酶抑制活性(IC50,～ 0.25 μmol/L).乙酰肝素酶是內(nèi)源性的β-D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，在體內(nèi)能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的側(cè)鏈硫酸乙酰肝素，與多種生理病理過程緊密相關(guān)，包括組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及血管生成等[14].白玉蝸牛來源的AFG具有與其相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步采用HTRF法[13]系統(tǒng)分析AFG對乙酰肝素酶抑制作用，并探討抑制乙酰肝素酶的構(gòu)效關(guān)系.