柴達(dá)木黑果枸杞抗氧化物組分分析

王春雨，張志春，盧九斤，張 瑩，孫豐豪，盛海彥

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海省氣象局，西寧 810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)屬茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)的多棘刺灌木，主要分布于西北干旱鹽堿土荒漠地區(qū)。根據(jù)藏醫(yī)藥典《四部醫(yī)典》《晶珠本草》的記載，黑果枸杞主治心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證明黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、降血糖、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等功效[2-5]。其良好的醫(yī)用功效主要得益于果實(shí)中豐富的多酚、維生素E和黃酮等生物活性物質(zhì)[6]。多酚能清除體內(nèi)氧自由基，預(yù)防心腦血管疾病和抵抗機(jī)體老化[7]。維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素，能減少有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，可以起到護(hù)膚美容和增加機(jī)體免疫力的功能，是最主要的抗氧化劑之一[8]。黃酮類化合物具備抵抗氧化和降低血脂活性等特性[9-10]。

在青海柴達(dá)木盆地，黑果枸杞集中分布于格爾木、都蘭、德令哈、烏蘭等盆地中東部地區(qū)，能抗風(fēng)固沙，是荒漠戈壁重要的建群植物[2,11]。研究表明，柴達(dá)木盆地所產(chǎn)黑果枸杞原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于新疆中、北、南部，寧夏，甘肅及內(nèi)蒙所產(chǎn)黑果枸杞，表現(xiàn)出道地性特征[12-13]。黑果枸杞是典型的集生態(tài)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值于一身的荒漠鹽堿地區(qū)原生樹種，對(duì)維持柴達(dá)木盆地生態(tài)平衡有重要意義，有極高的開發(fā)利用價(jià)值。

矯曉麗等[14]分析研究了青海可魯克湖周邊生長(zhǎng)的野生黑果枸杞脂肪、多糖、總黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；樊光輝等[8]分析了青海諾木洪地區(qū)人工栽培黑果枸杞氨基酸、維生素E、總黃酮等有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；劉桂英等[15]對(duì)比分析了青海諾木洪、格爾木、德令哈3個(gè)地區(qū)的野生黑果枸杞表型性狀。前人在探索黑果枸杞特性方面做了大量工作，但研究涉及地區(qū)范圍較小，相對(duì)柴達(dá)木盆地范圍內(nèi)野生黑果枸杞來說存在一定局限性，系統(tǒng)調(diào)查柴達(dá)木盆地野生黑果枸杞的抗氧化組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了柴達(dá)木盆地野生黑果枸杞中多酚、總黃酮和維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并對(duì)多酚和花青素組分構(gòu)成做了初步探究，樣地范圍基本涵蓋柴達(dá)木地區(qū)野生黑果枸杞典型分布區(qū)，以期為黑果枸杞優(yōu)質(zhì)品種的選育、栽培、質(zhì)量評(píng)價(jià)及迅速開發(fā)利用積累科學(xué)數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

柴達(dá)木盆地位于東經(jīng)90.27～99.27°、北緯35.00～39.33°之間。柴達(dá)木盆地為阿爾金山、祁連山和昆侖山所環(huán)繞的不規(guī)則內(nèi)陸山間斷陷盆地，盆地西高東低，西寬東窄，略呈三角形，東西長(zhǎng)約800 km，南北寬約300 km，面積 25.78×104km2，地勢(shì)自西北向東南緩傾，海拔為2 600～ 3 000 m。盆地內(nèi)土壤為灰棕漠土、鹽土、風(fēng)沙土、棕鈣土和少量粗骨土，研究區(qū)域內(nèi)主要為灰棕漠土和鹽土。盆地屬高原大陸性氣候，以干旱為主要特征。本試驗(yàn)在柴達(dá)木盆地中東部野生黑果枸杞典型原生分布區(qū)上進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

黑果枸杞為2016年8月采摘于研究區(qū)內(nèi)。每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇20～30株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的植株，采摘成熟且大小均勻一致的鮮果1～2 kg，自然晾曬風(fēng)干后，去除果蒂，粉碎過40目篩，-20 ℃保存待用。樣品采集信息見表1。

主要試劑：鹽酸(色譜純，上海安譜公司)、甲醇(色譜純，上海安譜公司)、沒食子酸、福林酚試劑、去離子水、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、生育酚標(biāo)準(zhǔn)品。試劑除特殊注明外均為分析純。

主要儀器：超聲波清洗儀(KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司)、離心機(jī)(DIGICEN 21R，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器)、紫外分光光度儀(TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、索氏提取儀(WSC-SXT-02，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(Q-Exactive，ThermoFisher)、高效液相色譜儀(L6-DP6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；色譜柱(Column Heater L6-C01，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；在線脫氣機(jī)(DG55-2，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

表1 樣品采集信息表Table 1 Information table of sample collection

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 利用超聲輔助法提取黑果枸杞多酚[16]；利用福林酚法測(cè)定總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)[17]；利用超高效液相色譜—串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜技術(shù)對(duì)多酚進(jìn)行分離鑒定[18]，略做改動(dòng)。

儀器條件為色譜系統(tǒng)：Dionex Ultimate 3000 RSLC；色譜柱：Hypersil GOLD aQ，100 mm× 2.1 mm，1.9 μm；流動(dòng)相：A：0.9%乙酸水溶液；B：甲醇(色譜純)；進(jìn)樣量： 3 μL；流速：0.3 μL·min-1；質(zhì)譜系統(tǒng)：Thermo Q-Exactive。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.156x+1.149 1(R2=0.990 5)。

1.3.2 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 利用有機(jī)溶劑法提取黑果枸杞總黃酮；利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定黑果枸杞中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[19]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=233.6x-0.353 3(R2=0.999 2)。

1.3.3 維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 維生素E的提取與測(cè)定方法參考劉紅河等[20]的反相高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-DAD)，略作 改動(dòng)。

儀器條件為流動(dòng)相甲醇(分析純)∶乙腈(分析純)= 93∶7，流速1.0 mL·min-1，柱溫 30 ℃， 280 nm波長(zhǎng)掃描。以生育酚為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y= 1.787 4e-0.04x+1.258 4(R2=0.994 4)。

1.3.4 花青素鑒定及半定量分析 測(cè)定方法為UPLC-MS-MS[21]，略做改動(dòng)。

用1%鹽酸—甲醇溶液反復(fù)提取粉粹樣品中的花青素，提取液過0.22 μm濾膜，用ThermoFisher Q-Exactive LC-MS/MS對(duì)樣品提取液進(jìn)行測(cè)定分析。

儀器條件為色譜柱C18(100×4.6 mm)；二元流動(dòng)相分別為A相： 0.9%乙酸水溶液，B相： 0.9%乙酸乙腈溶液；梯度洗脫條件如下：柱溫 30 ℃；流速0.3 mL·min-1；0～5 min，A相從97%降至90%；5～10 min，A相降至70%；10～15 min，A相降至60%；15～20 min，A相降至20%；25～25 min， A相提升至97%；27～30 min，A相保持97%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪制圖表，均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示數(shù)據(jù)。采用DPS 7.05軟件中Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表2可知，所檢測(cè)的12個(gè)樣品中總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(8.19±0.50)～(28.60±0.54) mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.92 mg·g-1，不同樣品間質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異極顯著(P<0.01)。其中GEM2與MH總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于其他樣品；NMH1極顯著低于其他樣品；DCD顯著高于DLH2，DLH2又顯著高于DGL；DLH2>ZJ>DLH1>GEM1>NMH2>WTMR，但未達(dá)顯著水平。總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)格爾木、諾木洪地區(qū)栽培型高于野生型，德令哈地區(qū)栽培型與野生型質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)。與閆亞美等[16]測(cè)得黑果枸杞多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.25～87.77 mg·g-1的結(jié)果相似。

總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(1.63±0.10)%～ (3.15±0.16)%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.39%，不同樣品間質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在極顯著差異(P<0.01)。其中DCD、WTMR、GEM1、BKL、MH質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高；DGL、DLH1、DLH2、NMH1總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于其他地區(qū)(P<0.05)?？傸S酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)格爾木和德令哈地區(qū)栽培型與野生型差異不顯著，諾木洪地區(qū)栽培型質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生型。與李兆君等[19]利用分光光度法測(cè)得寧夏黑果枸杞的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.71%的結(jié)果相似。

維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.08±0.01)～ (0.96±0.02) mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51 mg·g-1，不同樣品間質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在極顯著差異(P<0.01)。其中，DGL維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于其他樣品；DLH1與DLH2極顯著低于其他樣品；BKL>GEM1>GEM2但未達(dá)顯著水平；GEM2顯著高于DCD，DCD>ZJ但未達(dá)顯著水平；ZJ顯著高于NMH1，NMH1>NMH2但未達(dá)顯著水平；WTMR質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于NMH2但未達(dá)顯著水平，但顯著低于NMH1。維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)野生型與栽培型不存在顯著差異。與王琴[22]測(cè)得新疆黑果枸杞維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.46 mg·g-1的結(jié)果相似。

表2 黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of total polyphenols、total flavonoids and vitamin E in Lycium ruthenicum murr

注：不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異，不同大寫字母表示在0.01水平存在顯著差異；1表示野生型，2表示栽培型；下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level,and different uppercase letters indicate significant difference at 0.01 level; 1 means wild type,2 means cultivated type; the same below.

2.2 黑果枸杞多酚類物質(zhì)(非花青素)的分離 鑒定

采用反相高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)法，在黑果枸杞中利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)兒茶素、綠原酸、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸、沒食子酸、橙皮苷、山奈酚、柚皮素、柚皮甙、OPC-A2、OPC-B2、對(duì)香豆酸、根皮素、原兒茶酸、槲皮素、丁香、香草酸共18種多酚類物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定。由表3可知，其中咖啡酸、山奈酚、柚皮素、對(duì)香豆酸、槲皮素被最終檢測(cè)并定量?？Х人豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)變幅為(1.31±0.03)～(11.99±0.32) mg·kg-1，馬海質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，諾木洪人工栽培質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變幅為(1.44±0.01)～(6.31±0.09) mg·kg-1，大柴旦最高，大格勒最低。柚皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(18.7±1.72)～(101.22±1.60) mg·kg-1，大柴旦最高，德令哈人工栽培最低。槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)烏圖美仁最高，大格勒最低，整體變幅為(55.33±2.50)～(131.83±2.21) mg·kg-1。供試的12個(gè)樣品中均含有咖啡酸、山奈酚、柚皮素和槲皮素，其中9個(gè)樣品中均檢測(cè)到了對(duì)香豆酸的存在，但DCD、DLH1、WTMR未檢出。推測(cè)可能是地理差異、遺傳差異等因素造成了不同樣品之間多酚組分構(gòu)成不同，具體原因有待進(jìn)一步研究探明。

表3 黑果枸杞多酚各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Content of each component of polyphenols in Lycium ruthenicum murr

2.3 黑果枸杞花青素類物質(zhì)分離鑒定

如表4、圖1所示，檢測(cè)結(jié)果表明，柴達(dá)木黑果枸杞花青素母核主要有4種，分別是矮牽牛素(m/z317)、飛燕草素(m/z303)、錦葵素(m/z331)和矢車菊素(m/z287)。

黑枸杞花青素主要由這4種母核鍵合糖苷等物質(zhì)衍生而來，在供試樣品中共發(fā)現(xiàn)12種花青素類化合物。其二級(jí)質(zhì)譜碎片大多是由母核離子失去糖基而得到，因此具有一定的特征。通過對(duì)母核離子以及碎片的特征信息進(jìn)行分析鑒定，并結(jié)合文獻(xiàn)資料，對(duì)其中10 種花青素類化合物進(jìn)行了命名，結(jié)果如表5所示。

表4 黑果枸杞主要花青素母核Table 4 Main anthocyanin core of Lycium ruthenicum murr

圖1 黑果枸杞花青素母核結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of anthocyanin mother core of Lycium ruthenicum murr

表5 黑果枸杞花青素信息Table 5 Athocyanins extract of Lycium ruthenicum murr

12種花青素類化合物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同樣品間有所變化(表6)。結(jié)果表明矮牽牛素-3-O-順式香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷(或矮牽牛素-3-O-反式香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷)是柴達(dá)木野生黑果枸杞花青素的主要成分，占花青素總量的 49.42%～79.13%。但馬海地區(qū)(MH)黑果枸杞矮牽牛素-3-O-對(duì)香豆酸-槐糖苷-5-O-葡萄糖苷占總花青素的40.00%，較矮牽牛素-3-O-香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷高1.62%?？偟膩碚f不同采集點(diǎn)黑果枸杞花青素總體組成模式基本相同，但個(gè)體之間各類母核離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)及各花青素濃度不同，造成這一差異的原因可能是地理、氣候環(huán)境、地球化學(xué)元素以及遺傳等多因素共同作用的結(jié)果，有待進(jìn)一步深入研究。

表6 黑果枸杞各花青素的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 Relative content of each anthocyanin in Lycium ruthenicum murr %

3 討論與結(jié)論

果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低往往決定了果實(shí)品質(zhì)的好壞，果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以作為評(píng)價(jià)果實(shí)質(zhì)量的依據(jù)和參考[28]。總多酚、總黃酮、維生素E是重要抗氧化物質(zhì)組分。有研究表明，紅果枸杞的總多酚、總黃酮和維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.43 mg·g-1、1.67%和0.11 mg·g-1[29-30]，黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.92 mg·g-1、 2.39%和0.51 mg·g-1，是紅枸杞質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 7.37倍、1.43倍和4.54倍，黑果枸杞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯優(yōu)于紅果枸杞。菲爾杜德和寶石紅兩個(gè)品種的紅樹莓總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.74 mg·g-1和2.87 mg·g-1[31]，供試黑果枸杞的總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均達(dá)17.92 mg·g-1，明顯高于紅樹莓。

德令哈、格爾木、諾木洪地區(qū)野生黑果枸杞的總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.61 mg·g-1、15.20 mg·g-1、8.19 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.70 mg·g-1、28.60 mg·g-1、16.14 mg·g-1；德令哈、格爾木、諾木洪地區(qū)野生黑果枸杞總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 1.84%、2.85%、1.63%，人工栽培黑果枸杞總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.78%、2.44%、2.34%；德令哈、格爾木、諾木洪地區(qū)野生黑果枸杞維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.10 mg·g-1、0.71mg·g-1、0.36 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.08 mg·g-1、0.65 mg·g-1、0.32 mg·g-1。人工栽培與野生黑果枸杞營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)或人工栽培質(zhì)量分?jǐn)?shù)較野生黑果枸杞顯著提升，說明人工栽培不會(huì)影響黑果枸杞營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，且生長(zhǎng)環(huán)境良性改變有助于黑果枸杞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。這一發(fā)現(xiàn)與祁銀燕等[32]研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)矮牽牛素(m/z317)、飛燕草素(m/z303)、錦葵素(m/z331)和矢車菊素 (m/z287)是柴達(dá)木黑果枸杞花青素的主要母核物質(zhì)，其果實(shí)中所含花青素主要由這4種母核物質(zhì)鍵合糖苷等衍生而來。前人研究認(rèn)為黑果枸杞不含有矢車菊素衍生物[24]，本研究發(fā)現(xiàn)矢車菊素也是黑果枸杞花青素的主要母核物質(zhì)，補(bǔ)充了前人研究結(jié)果。呂玉姣等[33]在新疆庫(kù)爾勒地區(qū)黑果枸杞中發(fā)現(xiàn)了天竺葵素衍生物，而在本研究中未檢測(cè)到，推測(cè)可能是地理因素導(dǎo)致的這一差異。在柴達(dá)木黑果枸杞中共發(fā)現(xiàn)12種花青素類化合物，并對(duì)其中10種進(jìn)行命名。不同地區(qū)黑果枸杞多酚和花青素的構(gòu)成模式基本相同，但各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、占比均不同，具體原因有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)供試樣品基本覆蓋了柴達(dá)木盆地黑果枸杞資源類型，研究結(jié)果對(duì)柴達(dá)木盆地黑果枸杞資源的人工選育和栽培提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論 指導(dǎo)。