用SMMC-7721和Hep-G2全二維細(xì)胞膜-整體柱色譜聯(lián)用技術(shù)篩選中藥鴉膽子的抗癌活性物質(zhì)

紀(jì)松崗，丁璇，曹巖，陳嘯飛，賈丹，王冬堯，柴逸峰(.解放軍40醫(yī)院藥劑科，山東青島 6607;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433)

·論著·

用SMMC-7721和Hep-G2全二維細(xì)胞膜-整體柱色譜聯(lián)用技術(shù)篩選中藥鴉膽子的抗癌活性物質(zhì)

紀(jì)松崗1，丁璇2，曹巖2，陳嘯飛2，賈丹2，王冬堯2，柴逸峰2(1.解放軍401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

目的 篩選中藥鴉膽子中的抗癌活性成分。方法同時(shí)使用全二維色譜技術(shù)和細(xì)胞膜色譜技術(shù)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)。結(jié)果經(jīng)初步分離篩選，得到了腺苷和鴉膽子苦素B兩種潛在的抗癌活性成分。結(jié)論該方法對(duì)中藥中活性成分的篩選，具有快速、高效和在線的特色和優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞膜色譜;全二維色譜;SMMC-7721;Hep-G2;鴉膽子;抗癌

細(xì)胞膜色譜作為近幾年來(lái)新興的一種活性成分篩選技術(shù)，因其在線、高通量、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多的用于中藥活性成分的篩選研究［1］。該技術(shù)原理簡(jiǎn)單，即使用細(xì)胞膜與硅膠進(jìn)行孵育，得細(xì)胞膜-硅膠固定相，該固定相具有生物活性，使用該固定相裝填色譜柱，得到可以用于常規(guī)液相條件下的細(xì)胞膜色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)在線的自動(dòng)化高通量篩選［2］。中藥鴉膽子是苦木科植物鴉膽子Brucea javanica(L)Merr.的干燥成熟果實(shí)，近幾年來(lái)有研究證明從中提取得到的鴉膽子油具有潛在的抗癌活性［3］，我國(guó)于1978年開(kāi)始研制鴉膽子油乳，并用于治療各種惡性腫瘤，使用該劑型與化療和放療聯(lián)合使用，可以顯著改善治療效果(P＜0.05)［4］，但是其具體活性成分有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，細(xì)胞膜色譜具有高通量、快速的特點(diǎn)，十分適用于初步篩選鴉膽子中相關(guān)的抗癌活性成分。但是細(xì)胞膜色譜作為一種生物活性色譜，其效率較低、柱效較差［5］。為克服這些不足，本研究搭建了新型的SMMC-7721細(xì)胞-鴉膽子和Hep-G2細(xì)胞-鴉膽子的全二維細(xì)胞膜色譜-整體柱色譜的高通量活性成分篩選模型，用于篩選鴉膽子油的抗癌活性成分，可以有效提高細(xì)胞膜色譜對(duì)復(fù)雜體系成分的分離效能［6］，使得篩選結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

1 儀器和材料

1.1 儀器Angilent-1200高效液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)，Angilent-6200飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)，Chromolith RP 18e col-umn整體柱(德國(guó)，默克集團(tuán)有限公司)，RheodynetitanMX型電子控制十通閥(美國(guó)，藝達(dá)思科技有限公司)，十萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)，梅特勒公司)。

1.2 材料SMMC-7721細(xì)胞，Hep-G2細(xì)胞，硅膠(5 μm，大連美侖公司)，乙腈(色譜純，默克公司)，甲酸(色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司)，水由Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制備，鴉膽子(上海雷允上藥房)，石油醚為分析純，伊馬替尼對(duì)照品(南京安格醫(yī)藥化工有限公司)，四環(huán)素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

2 方法

2.1 SMMC-7721和Hep-G2細(xì)胞膜色譜的制備取一定量的SMMC-7721或Hep-G2細(xì)胞(3.5× 107)，經(jīng)超聲破碎后，低速離心10 min，取上清液12 000 g高速離心20 min，得細(xì)胞膜沉淀。然后將所得細(xì)胞膜沉淀物用5 ml生理鹽水復(fù)溶，與活化硅膠混合，在真空條件下渦旋反應(yīng)5 min，之后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中孵育12 h，得到細(xì)胞膜-硅膠固定相。

將孵育好的細(xì)胞膜色譜固定相取出，用PBS離心清洗3次(1 000 r/min，5 min)，再用4 ml PBS復(fù)溶，進(jìn)行細(xì)胞膜色譜柱裝填操作。將裝填好的細(xì)胞膜色譜柱用PBS在37℃下，用10 mmol/L醋酸銨溶液，以流速0.2ml/min，平衡1 h即可使用，每次進(jìn)樣量為5μl。

2.2 鴉膽子活性部位的提取用石油醚作為提取溶劑，按照7:1的液料比，在60°C水浴和400W的超聲條件下，提取2 h，完成鴉膽子活性部位的提取。

2.3 整體柱條件的探索色譜柱:Chromolith RP 18e column(100 mm×4.6 mm，5μm，德國(guó)，默克集團(tuán)有限公司);流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈;柱溫:26℃;總流速:5.0 ml/min;具體梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

圖1 全二維整體柱-細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)

表1 整體柱梯度洗脫條件

2.4 質(zhì)譜條件飛行時(shí)間質(zhì)譜儀使用電噴霧正離子全掃描模式。掃描范圍:110～1 100 m/z;毛細(xì)管電壓:3 500 V;霧化器壓力:30 psi;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:350℃;碎片電壓:120 V;分流比1∶10。

2.5 二維色譜模型的搭建全二維細(xì)胞膜-整體柱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)由三大部件組成。如圖1所示，該全二維系統(tǒng)包含一臺(tái)Agilent1200的高效液相色譜儀，一臺(tái)Agilent6200系列的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，以及一個(gè)可以切換A、B兩種連接狀態(tài)的十通閥。泵3將第一維細(xì)胞膜色譜中分離的成分沖入樣品儲(chǔ)備環(huán)中，待進(jìn)入第二維色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析。為加快全二維分析速度，十通閥上接有兩個(gè)500μl的樣品儲(chǔ)備環(huán)，將這兩個(gè)儲(chǔ)備環(huán)中的樣品，根據(jù)第二維色譜的分析分離時(shí)間，定為每隔320 s即自動(dòng)切換A和B狀態(tài)進(jìn)樣，由泵1和泵2按照梯度洗脫程序沖入整體柱色譜進(jìn)行第二維的分離，并于飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒別。當(dāng)十通閥狀態(tài)切換至A時(shí)，泵3將5μl鴉膽子提取液沖入細(xì)胞膜色譜柱，再富集于定量環(huán)1中，經(jīng)過(guò)2.5min富集后，定量環(huán)中充滿富集的組分，泵3停止工作，切換至B狀態(tài);此時(shí)泵1和泵2按照梯度洗脫程序，將定量環(huán)1中富集的組分沖入整體柱中進(jìn)行分離，利用TOFMS進(jìn)行成分分析，而泵3再次開(kāi)始工作并于2.5min后停止，停止后等待整體柱分析完成后再切換回A狀態(tài)。利用該切換閥的自動(dòng)切換功能，使其在A和B狀態(tài)間如此相互切換，從而實(shí)現(xiàn)鴉膽子活性成分在細(xì)胞膜色譜柱和整體柱上的在線全二維分析。

3 結(jié)果

3.1 全二維細(xì)胞膜色譜模型的適用性考察Hep-G2細(xì)胞核SMMC-7721細(xì)胞作為肝癌細(xì)胞系，具有豐富的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)［7，8］。因此，本研究采用具有EGFR拮抗性的伊馬替尼作為陽(yáng)性對(duì)照品［6］，采用四環(huán)素作為陰性對(duì)照品［9］，對(duì)搭建的全二維整體柱-細(xì)胞膜色譜模型進(jìn)行了適用性考察，兩種對(duì)照品的保留情況如圖2所示，縱坐標(biāo)代表一維色譜(整體柱色譜)上的保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表二維色譜(細(xì)胞膜色譜)上的保留時(shí)間，顏色深淺分別代表活性成分的響應(yīng)值從低到高。其中陰性對(duì)照品四環(huán)素(1)并無(wú)明顯保留趨勢(shì)，而陽(yáng)性對(duì)照品伊馬替尼(2)則具有較為明顯的保留行為。結(jié)果表明，所搭建的全二維色譜具有相應(yīng)的生物學(xué)活性，可以用于藥物活性篩選實(shí)驗(yàn)。

圖2 系統(tǒng)適用性考察

3.2 鴉膽子提取液中活性成分的篩選利用所搭建好的全二維細(xì)胞膜色譜模型，對(duì)鴉膽子提取液進(jìn)行了活性成分篩選實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)，構(gòu)建了鴉膽子提取液中所含活性成分的化合物庫(kù)，通過(guò)使用提取離子的方法，利用masshunter軟件，自動(dòng)對(duì)所得總離子流圖進(jìn)行［M+H］+峰提取，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研構(gòu)建的化合物庫(kù)，對(duì)比得到了腺苷(3)和鴉膽子苦素B(4)兩種潛在活性物質(zhì)，其在細(xì)胞膜色譜上的保留行為良好，有明顯的拖尾行為，具有潛在的生物學(xué)活性，如圖3所示。

圖3 活性成分篩選結(jié)果

4 結(jié)論

本研究利用細(xì)胞膜色譜技術(shù)、在線全二維技術(shù)和HPLC-TOFMS技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)中藥鴉膽子活性成分的在線全二維篩選，篩選和分離結(jié)果快速、準(zhǔn)確，共鑒定出兩個(gè)潛在的有效成分，其藥理活性和作用還需進(jìn)一步研究。該方法充分利用了細(xì)胞膜色譜的生物學(xué)活性、全二維技術(shù)的分離效能和質(zhì)譜技術(shù)的鑒定能力，改善了傳統(tǒng)細(xì)胞膜色譜分離效果差的現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)了在線的活性成分篩選和鑒定，操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、分離效果良好，可以為天然產(chǎn)物活性成分的分離分析提供一個(gè)良好的解決途徑。

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Screening of potential active anti-cancer com ponents of Brucea javanica by SMMC-7721 and Hep-G2 com prehensive two dimensional CMC-monolith chromatography

JISonggang1，DING Xuan2，CAO Yan2，CHEN Xiaofei2，JIA Dan2，WANG Dongyao2，CHAIYifeng2(1.Department of Pharmacy，No.401 Hospital of PLA，Qingdao 266071，China;2.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toscreen potential active anti-cancer components of Brucea javanica.MethodsThis research has employed comprehensive two dimensional chromatographic technology and cellmembrane chromatographic technology simultaneously with mass spectrometry as detector.ResultsAdenosine and Bruceine B were found to be potentially anti-cancer active.ConclusionThis study has combined the advantages of online，high speed and high throughput for the screen of potential active components of traditional Chinesemedicine.

cellmembrane chromatography;comprehensive two dimensional chromatography;SMMC-7721;Hep-G2;Brucea javanica;anti-cancer

O657.7 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號(hào)］1006-0111(2014)06-0425-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.007

2014-09-04

2014-10-08［本文編輯］陳靜

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(12401900802).

紀(jì)松崗，博士，主任藥師.E-mail:jisonggang@126.com.［通訊作者］柴逸峰，博士，教授.E-mail:yfchai@smmu.edu.cn.