木芙蓉葉黃酮成分抗氧化及月周期規(guī)律研究

程 鵬，鄔 潔，何先元,*，李昕燃，楊 鴻，黃英如

1重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心；2重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331；3云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明650504

木芙蓉葉是2015年版藥典新增收載的藥物，為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥葉[1]。夏、秋二季采收，干燥，防蟲、低溫儲(chǔ)藏。味辛，性平；歸肺、肝經(jīng)。具有涼血，解毒，消腫，止痛的功效。臨床用于治療癰疽焮腫，纏身蛇丹，燙傷，目赤腫痛，跌打損傷等病癥。含量照高效液相色譜法測(cè)定，按干燥品計(jì)算，含無水蘆丁(C27H30O16)不得少于0.070%。大多數(shù)黃酮類化合物均有較強(qiáng)的抗氧化自由基的作用，中藥的一些藥理活性也往往與其抗氧化自由基相關(guān)。木芙蓉葉中含有蘆丁等多種黃酮類化合物[2-5]，本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為主要指標(biāo)，測(cè)定一年內(nèi)不同月份采收木芙蓉葉的總黃酮含量變化規(guī)律，并檢測(cè)木芙蓉葉總黃酮體外抗氧化活性，采用超高效液相色譜法測(cè)定一年內(nèi)不同月份采收的木芙蓉葉4種黃酮成分含量變化規(guī)律，分析黃酮成分與抗氧化活性之間的相關(guān)性，以探討木芙蓉葉黃酮組分-成分-效應(yīng)之間聯(lián)系，為評(píng)價(jià)木芙蓉葉藥材質(zhì)量和進(jìn)一步開發(fā)利用木芙蓉葉提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1200型，上海美普達(dá)儀器有限公司)、超聲清洗儀(批號(hào)：15C4649，寧波新芝生物科技股份有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(批號(hào)：O803141，上海躍進(jìn)器械醫(yī)療有限公司)、TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(批號(hào)：5110080098，長(zhǎng)沙湘離心機(jī)儀器有限公司)、PH計(jì)(編號(hào)17103029，成都世紀(jì)方舟科技有限公司)、電子天平(型號(hào)：FA2004，上海舜宇恒平儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：DGG-9240B，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、分子生物型超純水機(jī)(型號(hào)：STS18-0321-012，重慶市安特生環(huán)保設(shè)備有限公司)、UFLC超快速高效液相色譜儀(島津)、色譜柱C18色譜柱(批號(hào)：V3250001，上海安普公司)、移液槍(型號(hào)：YE4A178905)。

1.2 試劑

蘆丁(C27H30O16，HPLC≧98%，批號(hào)：R106912)、金絲桃苷(C21H20O12，HPLC≧98%，批號(hào)：18111901)、槲皮苷(C21H20O11，HPLC≧98%，批號(hào)：19031304)、PTIO(C13H17N2O2，HPLC≧98%，P838429)、DPPH(C18H12N5O6，HPLC≧98%，D141336)、抗壞血酸(C6H8O6，HPLC≧98%，A103537)、ABTS(C18H24N6O6S4，HPLC≧98%，批號(hào)：A109612)，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自重慶奧怡生物技術(shù)有限公司。槲皮素(C15H10O7，HPLC≧98%，批號(hào)19032803)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、過硫酸鉀、無水乙醇、甲醇、乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純。

1.3 材料

木芙蓉葉每月15日采自重慶醫(yī)科大學(xué)植物園，陰干備用，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)費(fèi)曜副教授鑒定為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisLinn的葉。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 木芙蓉葉總黃酮測(cè)定

2.1.1 樣品總黃酮提取

參考以最佳提取工藝[2]，稱取木芙蓉粗粉約3 g，置于250 mL的錐形瓶中，加入99 mL的46%乙醇溶液，在60 ℃，功率100 W條件下超聲提取2次每次34 min。濾過，合并濾液，低溫保存，備用。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取蘆丁5.40 mg，用50%的乙醇溶解后，定容于50 mL容量瓶中，配制為質(zhì)量濃度為1.08 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取該溶液0、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶。各組依次加入0.5% NaNO20.3 mL，混勻，放置6 min；再加入10% AlCl30.3 mL，搖勻，放置6 min；最后加入1 mol/L NaOH 4 mL，并以50%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置15 min。用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(檢測(cè)波長(zhǎng)510 nm)。y=0.086 1x+0.001 4。R2=0.999 8(x為吸光度，y為濃度單位mg/mL)。

不同月份采收木芙蓉葉的總黃酮提取液按上述方法，分別測(cè)定其總黃酮濃度，并記錄C，然后將總黃酮提取液配制為300 μg/mL的母液，備用。

2.2 抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 維生素C的標(biāo)準(zhǔn)液配置

精密稱取Vc標(biāo)準(zhǔn)品16.4 mg，用50%的乙醇溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中，作為母液備用。

2.2.2 抗氧化性活性實(shí)驗(yàn)

依據(jù)酸性介質(zhì)中，還原劑存在的條件下，正磷酸根離子與鉬酸銨形成藍(lán)色絡(luò)合物，在700 nm有較強(qiáng)的紫外吸收，且吸光度值大小與還原能力即抗氧化的能力成正比的原理。

分別精密移取各樣品母液和Vc標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于試管中，(依照設(shè)置的濃度梯度20、40、60、80、100、150、200、250 μg/mL加樣)，以50%乙醇溶液作空白。依次加入0.6 mol/L硫酸溶液1mL，28 mmol/L磷酸鈉溶液1.5 mL，4 mmol/L鉬酸銨溶液1.5 mL，蒸餾水1 mL，搖勻后，于95 ℃水浴90 min，取出極速冷卻后，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)695 nm處測(cè)定吸光度并記錄A。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用同法制備相同濃度梯度的 Vc 做對(duì)比試驗(yàn)，下同。

2.2.3 DPPH實(shí)驗(yàn)

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在自由基清除劑存在的條件下DPPH中氮原子上的單電子被捕獲，溶液顏色變淺。在517 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品自由基清除率。

分別精密移取各月份樣品母液和Vc標(biāo)準(zhǔn)品母液各2 mL后(依照設(shè)置的濃度梯度4、8、20、40、60、100、150 μg/mL加樣)，再加入2 mL DPPH作為實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。避光放置30 min，在紫外517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)吸光度A，用2.0 mL的50%乙醇溶液+2.0 mL DPPH作為空白對(duì)照A1；2.0 mL無水乙醇+2.0 mL樣品溶液作樣品對(duì)照A0。

DPPH自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)× 100%

2.2.4 ABTS實(shí)驗(yàn)

ABTS在氧化劑存在時(shí)被氧化成綠色，抗氧化物存在時(shí)則被抑制，在414或734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，可計(jì)算總抗氧化能力。吸光度大小與還原能力即抗氧化的能力成反比。

ABTS粉末用蒸餾水溶解成濃度為7 mmol/L的試液，再與濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀按比例混合，室溫，避光靜置過夜，使用時(shí)用無水乙醇稀釋成工作液(要求在734波長(zhǎng)下吸光度在0.68～0.72范圍，實(shí)際稀釋了約100倍)。

參考文獻(xiàn)方法，分別精密移取各月份樣品母液和Vc標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 mL后(依照設(shè)置的濃度梯度4、8、10、20、40、80、100、150 μg/mL加樣)，再加入3.6 mL ABTS工作液作為實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。加入后振搖使混合均勻，靜置6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光度，記為A。另外設(shè)置樣品對(duì)照組以0.4 mL樣品溶液+3.6 mL無水乙醇(2組)，吸光度記為A0；空白對(duì)照3.6 mL ABTS工作液+0.4 mL 50%的乙醇溶液(3組)吸光度記為A1，其余操作與實(shí)驗(yàn)組同。

ABTS自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)× 100%

2.2.5 PTIO實(shí)驗(yàn)

PTIO在甲醇和水溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，在自由基清除劑存在的條件下PTIO上的單電子被捕獲，溶液顏色變淺。在557 nm處測(cè)定吸光度，可以計(jì)算樣品自由基清除率。

分別精密移取各月份樣品母液和VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL后(依照設(shè)置的濃度梯度10、40、60、100、200、250、300 μg/mL加樣)，再加入2 mL PTIO作為實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。37 ℃水浴并避光反應(yīng)3 h，在557 nm測(cè)吸光度A。用1.0 mL的50%乙醇溶液+2.0 mL DPPH作為空白對(duì)照A1；2.0 mL無水乙醇+1.0 mL樣品溶液作樣品對(duì)照A0。

PTIO自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)×100%

2.3 UFLC法測(cè)定木芙蓉葉黃酮成分

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的配制

精密移取2.1.1項(xiàng)下各月份木芙蓉葉總黃酮母液300 μg/mL作為供試品溶液。

綜合前人研究結(jié)果，選取極性分布均勻的蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素等4個(gè)成分作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別精密稱取蘆丁8.18 mg、金絲桃苷7.26 mg、槲皮苷7.15 mg、槲皮素8.09 mg，50%乙醇為溶劑定容于50 mL容量瓶中，配制濃度為163.6、145.2、143、155.6 μg/mL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以50%乙醇溶液為空白對(duì)照，“2.3.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以0.1%的冰醋酸溶液-乙腈為流動(dòng)相，C18柱為固定相，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm，按照優(yōu)化的濃度梯度(表1)。進(jìn)樣0、1、2、4、8、15、20 μL，每個(gè)體積重復(fù)進(jìn)樣2次。記錄各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的平均峰面積值，計(jì)算含量。

表1 LC時(shí)間程序

2.3.3 木芙蓉葉總黃酮樣品成分分析

不同月份采收的供試品溶液經(jīng)微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣20 μL，參照2.3.2項(xiàng)下的分析方法進(jìn)行成分分離，每個(gè)供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣一次。記錄不同月份采收供試品中標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的峰面積值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 4～11月木芙蓉葉總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

分光光度法測(cè)定4～11月木芙蓉葉總黃酮含量變化趨勢(shì)如圖1，8月份總黃酮含量最高，4月份次之，11月份最低?？傮w趨勢(shì)高-低-高-低-高-低。11月份葉片接近枯黃脫落，總黃酮含量下降速度最快。

圖1 4～11月木芙蓉葉總黃酮含量變化趨勢(shì)

3.2 木芙蓉葉總黃酮抗氧化結(jié)果

3.2.1 木芙蓉葉總黃酮抗氧化性活性結(jié)果

根據(jù)抗氧化力測(cè)定的基本原理，從圖2可以看出，每個(gè)月木芙蓉葉總黃酮抗氧化性活性，隨著濃度的增加而增加，但與對(duì)照品Vc相比，提高幅度不大，特別是在高濃度條件下，更是明顯。

圖2 不同月份不同濃度木芙蓉葉總黃酮抗氧化性變化趨勢(shì)

圖3 4～11月木芙蓉葉總黃酮抗氧化性變化趨勢(shì)

從圖3來看，總黃酮抗氧化活性4月份最低，5和6月份上升，7、8月份下降，9月份升高，10、11月份下降，總體呈現(xiàn)出雙“S”曲線，與植物生長(zhǎng)大周期基本一致，可以推測(cè)，木芙蓉葉總黃酮抗氧化活性物質(zhì)與生長(zhǎng)代謝物質(zhì)變化相關(guān)。

3.2.2 木芙蓉葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

以8月份木芙蓉葉總黃酮與對(duì)照品Vc對(duì)比研究，木芙蓉葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力，從圖4可以看出，其清除能力隨濃度增高而增強(qiáng)，濃度60 μg/mL以后增速減緩。以濃度100 μg/mL，測(cè)定4～11月木芙蓉葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖5所示，4月份和10月份較強(qiáng)，7月份和11月份較弱，呈現(xiàn)出一個(gè)弱“S”曲線。

圖4 木芙蓉葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖5 4～11月木芙蓉葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.2.3 木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力

從圖6可以看出，木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力隨濃度增大而增強(qiáng)，濃度在80 μg/mL以后增長(zhǎng)緩慢，幾乎接近對(duì)照品Vc的強(qiáng)度了。選取濃度150 μg/mL，測(cè)定4～11月木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力，結(jié)果如圖7，4月和9月較弱，6月和11月較強(qiáng)，也呈現(xiàn)出一個(gè)“S”曲線。

圖6 木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖7 4～11月木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖8 木芙蓉葉總黃酮對(duì)PTIO自由基的清除能力

圖9 4～11月木芙蓉葉總黃酮對(duì)PTIO自由基的清除能力

3.2.4 木芙蓉葉總黃酮對(duì)PTIO自由基的清除能力

從圖8可以看出，木芙蓉葉總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力隨濃度增大而緩慢增強(qiáng)。以濃度為300 μg/mL，測(cè)定4～11月對(duì)ABTS自由基的清除能力，結(jié)果如圖9，4、6、8、10月較強(qiáng)，5、7、9、11月較弱，基本呈現(xiàn)的是強(qiáng)-弱交替變化的趨勢(shì)。

3.3 UFLC法測(cè)定木芙蓉葉4種黃酮成分含量

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)2.3.2項(xiàng)下記錄的各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的平均峰面積值結(jié)果，以峰面積作為橫坐標(biāo)x，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為縱坐標(biāo)y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品含量的相關(guān)性，結(jié)果如表2。

表2 4種黃酮成分對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 UFLC法測(cè)定4種黃酮類物質(zhì)成分4～11月變化趨勢(shì)

UFLC法測(cè)定木芙蓉葉4種黃酮物質(zhì)，從圖10可以看到，總體來看，金絲桃苷含量最高，金絲桃苷含量在木芙蓉葉生長(zhǎng)周期內(nèi)呈現(xiàn)出高-低-高-低變化趨勢(shì)，其中7月和11月含量急劇下降。蘆丁含量變化總體比較平緩，11月含量下降較快。槲皮苷含量5月最高，11月最低，總體呈現(xiàn)出“S”形變化趨勢(shì)。槲皮素含量4～5月增長(zhǎng)平緩，以后下降，9月增高，11月最高，呈現(xiàn)出與其他3個(gè)組分物質(zhì)不一致的變化趨勢(shì)。

圖10 4種黃酮成分含量4～11月變化趨勢(shì)

3.3.3 總黃酮及4種黃酮類物質(zhì)與抗氧化性相關(guān)比較結(jié)果

將總黃酮及4種黃酮類物質(zhì)4～11月含量變化趨勢(shì)與不同檢測(cè)方法的抗氧化性活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3?？傸S酮、蘆丁和金絲桃苷含量與總抗氧化性呈負(fù)相關(guān)。總黃酮、蘆丁、金絲桃苷和槲皮苷含量與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)，槲皮素與DPPH自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。金絲桃苷、槲皮苷和槲皮素與ABTS自由基清除率呈正相關(guān)，蘆丁與ABTS自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。蘆丁、金絲桃苷和槲皮苷與PTIO自由基清除率呈正相關(guān)，槲皮素與PTIO自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。總體來看，總黃酮和蘆丁與4種檢測(cè)抗氧化活性趨勢(shì)基本一致，槲皮苷與4種檢測(cè)抗氧化活性均呈現(xiàn)正相關(guān)，說明木芙蓉葉中槲皮苷組分抗氧化作用明顯。因此，在研究黃酮類物質(zhì)抗氧化性活性時(shí)，不能以一種檢測(cè)方法來確定其強(qiáng)弱，而是要綜合考慮。

表3 黃酮類物質(zhì)與抗氧化性相關(guān)系數(shù)

4 討論與結(jié)論

木芙蓉葉總黃酮含量8月份最高，11月份最低，黃酮成分蘆丁含量10月份最高，11月份最低，金絲桃苷含量6月份最高，11月份最低、槲皮苷含量5月份最高，11月份最低、槲皮素含量4月份最高，8月份最低?？偪寡趸钚?月份最強(qiáng)，DPPH自由基清除率10月份最強(qiáng)，ABTS自由基的清除能力6月份最強(qiáng)，PTIO自由基的清除能力10月份最強(qiáng)。蘆丁每個(gè)月含量變化起伏不大，結(jié)合抗氧化活性強(qiáng)弱，木芙蓉葉中蘆丁成分可以作為藥效評(píng)價(jià)和木芙蓉葉藥材質(zhì)量的指標(biāo)。同時(shí)本研究進(jìn)一步說明現(xiàn)階段中藥藥效研究主要成分的合理性，中藥材采收期影響成分含量及其藥效，中藥的藥效是多組分綜合效應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果，為中藥藥效研究需要提高成分分離技術(shù)，多成分檢測(cè)技術(shù)提供了理論依據(jù)。