菝葜醇提物對小鼠脂肪代謝酶的影響

李 欣，潘永芳，王 娜，楊麗聰，鄭國棟

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045）

【研究意義】肥胖是指一定程度的明顯超重與脂肪層過厚，是體內(nèi)中性脂肪過多積聚的表現(xiàn)。肥胖是一種典型慢性代謝疾病，它不僅影響人的體形，也與一些疾病有密切相關(guān)，如冠心病、高血壓、2型糖尿病、高血脂等[1-3]。隨著國民生活水平不斷提高，飲食習(xí)慣的日趨歐美化，我國肥胖癥發(fā)病率呈逐年上升。因此，肥胖已經(jīng)成為了一個(gè)國民關(guān)注的健康問題，預(yù)防與治療也受到越來越多人的重視。目前，肥胖的治療最常用的方法是服用化學(xué)合成的減肥藥，長期服用不僅效果不理想，而且會(huì)對人體產(chǎn)生一定的副作用。因此，研究人員開始研究具備減肥功能且毒副作用低的天然產(chǎn)物，可通過日常飲食達(dá)到預(yù)防和治療肥胖的效果?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】菝葜（Smilax chi na L.），百合科菝葜屬植物，生長于海拔2 000 m以下的丘陵、河谷或山坡上，在我國的長江以南廣泛分布[4]。菝葜入藥的歷史悠久，古代醫(yī)藥書籍，如《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》、《本草逢原》和《神農(nóng)本草經(jīng)疏》等書籍也都有記載。菝葜的全株均可入藥，有疔瘡癰腫，解毒散瘀祛風(fēng)利濕等功效[4]。從現(xiàn)代藥理方面的研究證明菝葜有抗腫瘤、降血糖、抗炎、抑菌等效果[5-7]。然而菝葜在減肥方面的研究還很少被報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者用菝葜粉末喂養(yǎng)小鼠16周，發(fā)現(xiàn)菝葜粉末能顯著的減少小鼠的體質(zhì)量增加和腹腔內(nèi)脂肪組織（IPAT）質(zhì)量，表明菝葜具有一定的減肥降脂性能[8]。但是菝葜什么組分有調(diào)節(jié)脂肪代謝還不清楚，其作用機(jī)制又如何？因此本研究通過乙醇提取菝葜，分析菝葜醇提物（SCE）中的活性物質(zhì)，并將0.25%，0.50%和1.00%的SCE添加到飼料中投喂小鼠，測定小鼠體質(zhì)量增加變化、IPAT質(zhì)量、肝臟中脂類代謝相關(guān)酶的指標(biāo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】SCE降脂減肥作用有哪些組分構(gòu)成，能否通過AMPK，促進(jìn)脂類代謝，達(dá)到減肥作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

50只體質(zhì)量約20 g雌性ICR小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），許可證號：SCXK（湘）2011-0003。菝葜購于南昌藥店（產(chǎn)地：安徽亳州市）。

飼料配制：SCE與高脂粉末飼料進(jìn)行混合，配制成0.25%，0.50%和1.00%SCE混合飼料。

主要試劑：沒食子酸、蘆丁、薯蕷皂苷、綠原酸、白藜蘆醇、落新婦苷、黃杞苷等標(biāo)準(zhǔn)品購自上海同田生物技術(shù)有限公司；小鼠?；o酶A氧化酶（ACO、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）、脂肪酸合成酶（FAS）、AMP激活蛋白激酶（AMPK）的ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ALLN、AEBSF、二硫蘇糖醇、亮抑酶肽購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菝葜醇提物的制備 菝葜磨粉，過60目篩，用60%的乙醇以1∶20（Kg/L）的料液比浸泡1.5 h后，用超聲提取機(jī)超聲提取30 min，離心收集上清液，剩余沉淀再超聲提取，合并兩次收集的上清液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度在55℃下濃縮后，放入超低溫冰箱冷凍，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得到的SCE，裝入自封袋，放在干燥器中保存。

1.2.2 菝葜醇提物的檢測（1）SCE的總?cè)茰y定。稱取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，配成160μg/mL的工作液。用香草醛-冰醋酸法制作薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體參照文獻(xiàn)[9]，Y=0.108 1X+0.001 4（R2=0.998 6），樣品總?cè)坪扛鶕?jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

（2）SCE的總多酚測定。稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成210μg/mL的工作液。用福林酚試劑法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體參照文獻(xiàn)[9]，Y=0.086 1X+0.025（R2=0.999 6），樣品總多酚含量根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

（3）SCE中總黃酮的測定。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，配成320μg/mL的工作液，用硝酸鋁法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體參照文獻(xiàn)[9]，Y=0.012 3 X-0.003 3（R2=0.999 1）樣品總黃酮含量根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

（4）SCE成分的HPLC測定。用Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀分析SCE中的多酚成分含量。測定方法根據(jù)潘永芳[9]進(jìn)行。

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)及解剖 50只雌性ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機(jī)分成5組，對照組、高脂組、高脂添加0.25%、0.50%及1.00%SCE飼養(yǎng)8周，飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，每周稱量一次。飼養(yǎng)條件：室溫（24±2）℃，光暗周期12/12（08:00—20:00）。8周后，小鼠禁食12 h以上，用乙醚麻醉后解剖，摘取肝臟、IPAT并稱量，然后肝臟和IPAT放在-80℃冰箱保存，直到分析為止。

1.2.4 肝臟脂肪代謝酶活性分析 肝臟勻漿參照潘永芳[9]進(jìn)行。

FAS、ACO、CAT和AMPK活性根據(jù)相應(yīng)的ELISA試劑盒的使用說明書進(jìn)行分析[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用DPS統(tǒng)計(jì)軟件（Version.6.55）進(jìn)行student’t-test分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SCE主要成分及幾種活性成分的含量

SCE中3種組分總?cè)啤⒖偠喾?、總黃酮的含量分別為（14.03±0.21）%，（42.54±0.45）%，（29.69±0.37）%。SCE中的總多酚含量最高，達(dá)到42.54%。

圖1顯示混合標(biāo)曲及SCE的HPLC圖譜。經(jīng)分析得，SCE中的綠原酸、落新婦苷、黃杞苷和白藜蘆醇的含量 分別為（13.65±0.19）mg/g，（23.65±0.36）mg/g，（7.97±0.03）mg/g，（7.46±0.15）mg/g。

圖1 混合標(biāo)曲（A）與SCE（B）HPCL圖譜Fig.1 Chromatograms of standard mixture（A）and SCE（B）

2.2 小鼠體質(zhì)量、腹腔脂肪質(zhì)量變化

SCE對小鼠初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量、腹腔脂肪系數(shù)及肝臟系數(shù)的影響如表1所示。與高脂組相比，SCE投喂4周后，0.50%和1.00%SCE的小鼠體質(zhì)量增加量顯著減少。0.50%以上SCE投喂小鼠的腹腔脂肪系數(shù)明顯低于高脂組。各組小鼠肝臟系數(shù)均無顯著差異。綜上可知，0.50%以上SCE可能主要是通過降低小鼠腹腔內(nèi)脂肪沉積，減少體質(zhì)量增加。

2.3 小鼠肝臟脂類代謝相關(guān)酶活性的變化

表2是SCE對小鼠肝臟中脂類代謝酶活性的影響。與高脂組相比，1.00%SCE投喂的小鼠肝臟中CAT和ACO活性顯著提升，0.50%和1.00%SCE小鼠肝臟中AMPK活性明顯提高。而各組小鼠FAS活性均無顯著差異。

2.4 小鼠肝臟脂類代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的變化

圖2為SCE對小鼠肝臟及IPAT的脂類代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。與高脂組相比，1.00%SCE小鼠肝臟及IPAT中AMPK、CAT和ACO的mRNA表達(dá)量顯著增加。而各組小鼠肝臟及IPAT中FAS活性均無顯著差異。這些結(jié)果表明SCE增加小鼠的CAT、ACO和AMPK的基因表達(dá)量，并提高它們的活性，促進(jìn)脂肪的氧化，減少脂肪沉積。

表1 SCE對小鼠體質(zhì)量、腹腔內(nèi)脂肪及肝臟指數(shù)的影響Tab.1 Effects of SCE on body weight，intraperitioneal adipose tissues（IPAT）and liver indexes in mice

表2 SCE對小鼠肝臟中脂類代謝酶活性的影響（IU/mg蛋白）Tab.2 Effect of SCE on liver lipid metabolism related enzymes activity in mice（IU/mg protein）

圖2 菝葜醇提物對小鼠肝臟中脂類代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of SCE on lipid metabolism genes expression in liver and IPAT of mice

3 討 論

前期實(shí)驗(yàn)中以2%、4%和8%的菝葜粉末投喂小鼠，發(fā)現(xiàn)4%以上菝葜明顯減少小鼠的體質(zhì)量增加和IPAT質(zhì)量，表明菝葜有減肥功效[8]。本研究0.50%以上的SCE有減少體質(zhì)量增加和IPAT。通過分析SCE中主要組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCE中多酚含量較高，達(dá)到42.54%。有研究報(bào)道植物多酚對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠有減肥作用[11]。因此，本研究SCE抑制體質(zhì)量增加和IPAT質(zhì)量可能是由于菝葜多酚類化合物引起的。

通過分析SCE對肝臟和IPAT中脂類代謝酶的影響，發(fā)現(xiàn)SCE喂養(yǎng)的小鼠中CAT、ACO和AMPK的酶活性及基因表達(dá)量顯著提升。研究顯示苦瓜通過激活肝臟和肌肉的CAT酶的活性，增加脂肪氧化，減少大鼠體內(nèi)脂肪積累[12]。研究表明上調(diào)小鼠肝臟中AMPK的基因表達(dá)，從而促進(jìn)ACO、CAT的mRNA表達(dá)，提升ACO和CAT的活性，抑制脂肪沉積，減少體質(zhì)量增加[13-14]。在本試驗(yàn)中，0.50%以上的SCE顯著增加小鼠肝臟中ACO及CAT的活性及mRNA表達(dá)量，從而促進(jìn)小鼠體內(nèi)的脂肪酸β-氧化，減少脂肪沉積。

AMPK是一個(gè)重要的蛋白激酶，能調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝和能量需求，在調(diào)控體內(nèi)能量代謝中起著非常重要的作用[15]。激活A(yù)MPK抑制合成代謝，促進(jìn)分解代謝途徑開啟，是體內(nèi)主要的能量傳感器[16]。研究表明，激活A(yù)MPK提高HSL活性，促進(jìn)脂肪分解代謝[17]；增加ATGL蛋白表達(dá)水平，抑制體內(nèi)脂肪積累[18]；抑制細(xì)胞葡萄糖攝入和脂肪合成[19]。激活A(yù)MPK促進(jìn)磷酸化ACC和HMG-CoAR，抑制它們活性，從而減少脂肪酸和膽固醇的合成[20,21]。有研究報(bào)道用黃連素喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟質(zhì)量減少，血清和肝臟中脂類含量降低，預(yù)防肥胖效果，這些結(jié)果表明黃連素可以通過激活A(yù)MPK來達(dá)到減肥作用[22]。二甲雙胍（一種降糖藥劑）能提高胰島素敏感性的同時(shí)，還能通過激活A(yù)MPK促進(jìn)機(jī)體能量代謝、減少脂肪積累，抑制體質(zhì)量增加[23]。AMPK的激活還可以通過上調(diào)CAT的基因和蛋白表達(dá)來促進(jìn)脂肪酸的氧化[24]。因此，AMPK的激活可調(diào)控脂類代謝相關(guān)酶的基因和蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SCE減肥作用可能是由菝葜多酚類化合物引起的，其通過提升AMPK mRNA的表達(dá)量，調(diào)節(jié)小鼠肝臟和脂肪組織中的CAT和ACO的活性及基因表達(dá)水平，促進(jìn)脂肪氧化，從而減少小鼠體內(nèi)脂肪蓄積，降低體質(zhì)量增加。