雙氫青蒿素和達(dá)沙替尼聯(lián)合用藥對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用

安姿旖, 周兆， 劉革修

(暨南大學(xué) 血液研究所， 廣東 廣州 510010)

肝癌是世界上最常見的第5大惡性腫瘤，并在腫瘤相關(guān)死因中排位第2[1]，而肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular，HCC)是最常見的類型，比例高達(dá)90%[2].由于大部分患者確診時已為晚期肝癌[3]，使得姑息化療成為目前主要的治療手段之一.由于晚期肝癌患者的肝功能受損和常規(guī)化療藥物的非選擇細(xì)胞毒性，限制化療藥物的使用劑量和療程；另外由于肝癌細(xì)胞自身及所處腫瘤微環(huán)境形成的復(fù)雜，使化療藥物常常效果不佳，且容易發(fā)生化療耐藥.因此，迫切需要尋找新的治療方法應(yīng)對晚期肝癌.

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的衍生物，分子式C12H24O5[4]，相對分子量為284.35，具有水溶性強(qiáng)、易吸收、代謝迅速、毒副作用弱等優(yōu)勢，尤其是其口服生物利用度是青蒿素的10倍以上，抗瘧作用是青蒿素的4～8倍[5].研究證明，雙氫青蒿素不僅可以治療瘧疾，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長[6-7]，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[8]，逆轉(zhuǎn)耐藥[9].已有研究表明DHA可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[7, 10-11].

達(dá)沙替尼(dasatinib，Das)是一種高效、具有ATP競爭的口服雙Src/Abl激酶抑制劑，具有抗多種腫瘤增殖活性的作用.目前，達(dá)沙替尼被批準(zhǔn)用于治療耐藥或者不耐受伊馬替尼的慢性髓系白血病患者[12].c-Src作為一種受體絡(luò)氨酸激酶，是Src激酶家族中的一員，在肝細(xì)胞癌中高表達(dá).選用強(qiáng)有力的絡(luò)氨酸激酶抑制劑Das, 可抑制多種肝癌細(xì)胞的生長[13]，由于HCC細(xì)胞株亞群類別不同，對Das的藥物敏感性不同，其中HepG2屬于低敏感性細(xì)胞株，因此，本研究創(chuàng)新性提出將DHA與Das聯(lián)合用藥，探究DHA能否增強(qiáng)HepG2對Das的敏感性，讓兩種藥物在較低劑量聯(lián)合用藥時達(dá)到協(xié)同作用，從而對肝癌細(xì)胞系HepG2產(chǎn)生顯著的抑制，同時探索二者單獨及協(xié)同用藥時的分子機(jī)制，為臨床治療晚期HCC患者提供了一種新的方案.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心，置于DMEM高糖配方培養(yǎng)基中(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清)，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實驗，并根據(jù)實驗的需求進(jìn)行分組.

1.1.2 藥物與主要試劑

DHA購于普菲德，貨號D3793；Das購于Apexbio公司，貨號IR-53351；結(jié)晶紫、草酸銨購于天津大茂化學(xué)試劑廠；CCK8試劑盒購于Dojindo公司；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)購于碧云天公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒購買于凱基公司；c-Myc、cyclin E1、E2F1、GAPDH，Bim、Bcl-2、Cleaved-Caspase 9、β-actin、PARP、Cleaved-PARP和Nrf2抗體購買于Cell Signaling Technology 公司.

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 檢測藥物對HepG2細(xì)胞的活力的影響

取對數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞以5 000/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁，根據(jù)實驗分組加入DHA，Das，培養(yǎng)24 h，然后丟棄舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育3 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長處的光密度(OD)值.

1.2.2 平板克隆集落形成實驗

取對數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞分別以400/孔、600/孔和800/孔的密度接種于6孔板中，總體積為2000 μL，每個組設(shè)置4個復(fù)孔.培養(yǎng)6 d后換液并分別加入規(guī)定濃度的藥物，再培養(yǎng)4 d，棄上清，用PBS洗兩遍，加甲醇固定，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，棄染液并再次用PBS洗2遍，干燥后拍照.

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞，以105/孔的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中貼壁24 h，再加入藥物應(yīng)用48 h，收集細(xì)胞并用PBS洗2遍，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇4 ℃過夜固定細(xì)胞，PBS洗滌、離心，加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% RNase的PBS 100 μL，37 ℃水浴30 min，加入500 μL的 PI染液孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測.

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察和AO/EB染色法檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞應(yīng)用同上，在倒置顯微鏡下觀察藥物應(yīng)用48 h后，細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)的變化，然后收集細(xì)胞，離心去上清，用PBS洗兩次，加入AO/EB染液500 μL混合均勻，將細(xì)胞涂片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照.

1.2.5 Annexin V-PI法檢測細(xì)胞凋亡

分別收集藥物應(yīng)用24 h和48 h的細(xì)胞，棄上清，用PBS洗2遍，加400 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的 Annexin V和5 μL PI充分混勻，避光室溫孵育15 min，即刻用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析.

1.2.6 檢測細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen system, ROS)水平

收集藥物應(yīng)用48 h的細(xì)胞，用PBS洗3遍，接著用500 μL DHE重懸細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min后，離心棄上清，加300 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測.

1.2.7 JC-1染色流檢測線粒體膜電位變化

藥物作用36 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗3遍，加入500 μL JC-1染色工作液，重懸細(xì)胞吹打均勻，避光37 ℃孵育20 min，離心棄上清，加400 μL的緩沖液，即刻在流式細(xì)胞儀上檢測線粒體膜電位的下降比例.

1.2.8 Western blotting 檢測蛋白水平的表達(dá)

藥物應(yīng)用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，經(jīng)120 μL的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃， 12,000 r/min，離心10 min，收集上清.BCA法進(jìn)行蛋白定量，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行常規(guī)電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，切割目標(biāo)條帶，加入一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液清洗3次，加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液在凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，使用Image J分析軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析.

1.2.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制HepG2的細(xì)胞增殖

A:CCK8法檢測DHA對HepG2細(xì)胞毒性，1)與DHA濃度為0 μmol/L組比較P<0.001；B: CCK8法檢測Das對HepG2細(xì)胞毒性，2)與Das濃度為0 nmol/L組比較P<0.001；C:CCK8法檢測DHA(10 μmol/L)和Das(70 nmol/L)聯(lián)合應(yīng)用對HepG2細(xì)胞毒性，組間比較NS為差異無統(tǒng)計學(xué)意義，3)P<0.001；D-F:克隆形成實驗，DHA和Das單獨及聯(lián)合應(yīng)用對HepG2集落(400,600,800/孔)形成的影響(標(biāo)尺=50 mm)

A: HepG2 were cultured in medium with DHA and cell viability was measured by CCK-8 assay,1)P<0.001vs0 μmol/L DHA; B: HepG2 were cultured in medium with Das and cell viability was measured by CCK-8 assay, 2)P<0.001vs0 nmol/L Das; C: HepG2 were cultured in medium with Co-treatment of DHA(10 μmol/L) and Das(70 nmol/L ) and cell viability was measured by CCK-8 assay. 3)P<0.001,NS means no significance; D-F: Colony formation assay.Different density (400,600,800 per well) HepG2 cells were treated with the indicated groups(scale=50 mm).

圖1 DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制HepG2的細(xì)胞增殖

Fig.1 Combination-treatment of DHA and Das significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells

克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，DHA單獨應(yīng)用對3個接種不同密度細(xì)胞(400、600和800/孔)的克隆形成的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Das單獨應(yīng)用可抑制HepG2克隆形成；DHA協(xié)同Das作用時對HepG2克隆形成顯著抑制，以上結(jié)果說明， DHA可增加HepG2的化療敏感性，DHA協(xié)同Das可明顯抑制了HepG2細(xì)胞的增殖活性和克隆形成.

2.2 DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)HepG2細(xì)胞周期阻滯

流式結(jié)果顯示，與對照組相比，在G0/G1期， DHA單獨應(yīng)用組沒有差異變化，Das單獨應(yīng)用出現(xiàn)了HepG2細(xì)胞的G1期阻滯，聯(lián)合用藥組的G1期的上升比例較Das單獨應(yīng)用組更為明顯，由此可得，DHA和Das聯(lián)合給藥后HepG2肝癌細(xì)胞出現(xiàn)更加顯著的G1期阻滯(圖2A).

Western blot證明周期相關(guān)蛋白的變化，與對照組相比，DHA組和Das組分別單獨作用細(xì)胞時c-Myc、Cyclin E1和E2F1蛋白的表達(dá)水平均有所下降，二者聯(lián)合應(yīng)用3個蛋白表達(dá)水平較單獨應(yīng)用組降低更為明顯，結(jié)果提示DHA協(xié)同Das作用可顯著下調(diào)周期和增殖蛋白c-Myc、Cyclin E1和E2F1的表達(dá)水平(圖2B).

2.3 DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果顯示，DHA和Das單獨應(yīng)用均造成HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和抑制生長，二者聯(lián)合應(yīng)用時效果更為顯著，表現(xiàn)為大部分貼壁細(xì)胞脫落，懸浮在培養(yǎng)基中.AO/EB染色結(jié)果顯示，與對照組的細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的綠色相比較，DHA和Das單獨應(yīng)用組中，部分細(xì)胞呈現(xiàn)橙色或者紅色，部分呈聚縮的亮綠色的核，提示DHA和Das單獨應(yīng)用可誘導(dǎo)HepG2凋亡，而兩者聯(lián)合應(yīng)用時，顯示出正常的綠色核更少，大部分表現(xiàn)出聚縮的橙色、紅色的核和聚縮的亮綠色的核，提示HepG2的凋亡增加.由此可得DHA和 Das的聯(lián)合用藥促使HepG細(xì)胞凋亡增加(圖3A，B).

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測周期，1)與對照組比較P<0.01，2)與聯(lián)合應(yīng)用組比較P<0.01；B：Western blot檢測周期相關(guān)蛋白.

A: Flow cytometry and statistical analysis of cell cycle,1)P<0.01vsControl, 2)P<0.01vsCo-treat; B:Western blot analysis of G1/S transition-related proteins after indicated treatment.

圖2 DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用對HepG2細(xì)胞G1期阻滯

Fig.2 Combination-treatment of DHA and Das induces G1 arrest in HepG2 cells

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組和單獨應(yīng)用組相比，DHA和Das聯(lián)合應(yīng)用組HepG2細(xì)胞的凋亡比例顯著上升；應(yīng)用24 h和應(yīng)用48 h相比，隨著藥物聯(lián)合作用時間的延長，細(xì)胞的凋亡率也不斷增加.JC-1流式結(jié)果顯示， DHA和Das單獨應(yīng)用均可降低HepG2細(xì)胞的ΔΨm，藥物聯(lián)合應(yīng)用可使降低更加顯著.以上結(jié)果提示DHA和 Das聯(lián)合作用可增強(qiáng)通過由線粒體介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡(圖3C，D).

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，DHA和Das單獨作用HepG2細(xì)胞，上調(diào)促凋亡蛋白Bim, Cleaved-Caspase 9，Cleaved-PARP表達(dá)水平，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2以及DNA修復(fù)酶PARP表達(dá)水平，聯(lián)合應(yīng)用組可增強(qiáng)單獨用藥效果，使得促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著增加，抗凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著減少.這些結(jié)果提示DHA協(xié)同Das作用可促使線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑的激活，抑制細(xì)胞增殖(圖3E，F(xiàn)).

A-B:熒光顯微鏡及AO/EB染色檢測藥物對HepG2凋亡的形態(tài)學(xué)變化，A熒光顯微鏡(×400)，B標(biāo)尺=50 μm；C:流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物對HepG2凋亡的作用，1)與對照組比較P<0.01，2)與聯(lián)合應(yīng)用組比較P<0.01；D:JC-1染色法檢測線粒體膜電位

A-B: Morphological changes of apoptotic nuclei were observed by fluorescence microscopy and detected by AO/EB staining, scale, A:HE×400,B:scale=50 μm; C: Cell apoptosis induced by indicated groups was detected by flow cytometry, 1)P<0.01vsControl, 2)P<0.01vsCo-treat; D: Mitochondrial membrane potentials were measured using JC-1 staining and flow cytometry;

E-F: Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá).E-F: Western blot analysis of apoptosis-related proteins.

A:流式細(xì)胞技術(shù)檢測藥物應(yīng)用時胞內(nèi)超氧化物陰離子含量；B:Western blot 檢測抗氧化蛋白.A: ROS levels induced by indicated groups was detected by flow cytometry; B: Western blot analysis of antioxidant proteins.

Fig.4 Treatment of HepG2 cells by DHA and Das alone or in combination increases the production of ROS and decreases the expression of related antioxidant proteins

2.4 DHA和Das單獨及聯(lián)合應(yīng)用對HepG2細(xì)胞中ROS及抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

檢測胞內(nèi)ROS含量的流式結(jié)果顯示，與對照組相比，DHA組胞內(nèi)ROS含量增加，Das組的胞內(nèi)ROS含量則無變化；聯(lián)合應(yīng)用組與DHA應(yīng)用組比較,胞內(nèi)ROS含量增加更為顯著.以上結(jié)果說明，DHA通過促進(jìn)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生增加HepG2細(xì)胞對Das的敏感性.

Western blot結(jié)果顯示，對照組、DHA和Das單獨應(yīng)用以及聯(lián)合應(yīng)用組比較，聯(lián)合應(yīng)用組的Nrf2(抗氧化蛋白)的表達(dá)量最低，提示DHA可通過增加胞內(nèi)ROS含量，抑制Nrf2表達(dá)，增加HepG2對于Das敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

3 討論

肝細(xì)胞癌作為一種人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下[15].由于其起病的隱匿性，難以早期診斷，多發(fā)展為晚期肝癌，使得化療成為主要治療手段之一，部分化療藥的出現(xiàn)，延緩了肝癌的進(jìn)展，緩解了病情，但是肝癌化療藥物的耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重限制了其治療效果和應(yīng)用[16].

DHA作為由青蒿素還原后得到的一種人工半合成衍生物，近些年在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等方面得到了廣泛的關(guān)注，因為其副作用小，高效且有一定的特異性，所以在腫瘤治療領(lǐng)域探索也越來越深入[4].研究發(fā)現(xiàn)，DHA能夠增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞A549和SPC-A-1的對GEF(絡(luò)氨酸激酶抑制藥)藥物的敏感性，DHA和GEF聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和促使周期阻滯[17]，在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中，通過DHA和奧沙利鉑的聯(lián)合使用可顯著提高對癌細(xì)胞的抑制率，促進(jìn)DNA損傷，抑制腫瘤生長[18]，DHA和阿霉素的聯(lián)合應(yīng)用也可以增強(qiáng)對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，為阿霉素治療乳腺癌提供了一個有效的新方案[19].因此利用毒性較低的具備抗腫瘤活性的化合物，提高癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而減少化療藥物的用量，是一種提高抗腫瘤藥物化療作用而降低毒性的重要方法.

Das作為一種廣譜的絡(luò)氨酸激酶抑制劑，不僅可以作為臨床慢性粒細(xì)胞白血病的常用化療用藥，而且越來越多的研究表明，Das可通過血液/腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)對實體腫瘤進(jìn)行生長調(diào)節(jié)[20-22]，通過對不同的肝癌細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，Das對于肝癌的細(xì)胞株的敏感性具有明顯差異，為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，本研究選取Das低敏感性HepG2肝癌細(xì)胞，觀察Das單獨用藥及與DHA聯(lián)合用藥對HepG2細(xì)胞的抑制作用，探究相關(guān)分子機(jī)制，為Das和DHA進(jìn)入肝癌的臨床治療提供依據(jù).

本研究證實了Das和DHA單獨及聯(lián)合使用對HepG2肝癌細(xì)胞活性均有抑制作用，且聯(lián)合用藥時對癌細(xì)胞的抑制率大于單獨用藥，根據(jù)金氏公式分析可得，聯(lián)合用藥藥效為協(xié)同作用，并非單純的相加結(jié)果.觀察DHA和Das的聯(lián)合使用對HepG2細(xì)胞的周期和凋亡發(fā)現(xiàn)，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組HepG2的細(xì)胞凋亡率和G0/G1期細(xì)胞比例顯著提高，在細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變過程中扮演著重要角色周期相關(guān)蛋白c-Myc、Cyclin E1和E2F1，凋亡相關(guān)蛋白Bim、Bcl-2、cl-caspase9、cl-PARP和PARP也隨之發(fā)生變化, 聯(lián)合用藥促使周期蛋白、Bcl-2和PARP表達(dá)量顯著降低，Bim、cl-caspase9和cl-PARP表達(dá)量顯著提升，線粒體膜電位也顯著降低.以上結(jié)果提示，DHA協(xié)同Das可通過對HepG2的G1期阻滯，誘導(dǎo)線粒體相關(guān)凋亡通路，增強(qiáng)抑制癌細(xì)胞增長.ROS作為從氧氣分子中產(chǎn)生的一組活性氧化劑分子和自由基，可引起DNA雙鏈的斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的重新分布和凋亡[23]，DHA作用癌癥細(xì)胞后可誘導(dǎo)ROS明顯提高[24]，本研究也證明了這一點，在DHA協(xié)同Das 增加HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS含量增加，降低抗氧化蛋白Nrf2的表達(dá).

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了雙氫青蒿素和達(dá)沙替尼抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖，二者在一定濃度下聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同作用，顯著提高對癌細(xì)胞的抑制率.通過顯著下調(diào)c-Myc、Cyclin E1、E2F1、Bcl-2和PARP，上調(diào)Bim、cl-caspase9和cl-PARP的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1周期阻滯比例的顯著提升，為DHA和Das治療肝癌提供了理論和實驗依據(jù).然而，本研究仍存在諸多不足，后續(xù)將進(jìn)行更多的動物實驗和作用機(jī)制探索，進(jìn)一步提供完善的科學(xué)依據(jù).