促睡眠酸乳的制備及其功能評(píng)價(jià)

王平，周海燕，曾萬(wàn)鈞，李院，何赟，李志成

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.西安銀橋乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司，陜西 臨潼710600)

0 引言

快節(jié)奏的生活使加班熬夜、生活不規(guī)律的人群日益增多。人們長(zhǎng)期處于一種較緊張的狀態(tài)下，就很容易導(dǎo)致失眠的發(fā)生[1]。長(zhǎng)期失眠會(huì)嚴(yán)重影響患者的社交、學(xué)習(xí)、工作和認(rèn)知等日間功能，降低患者的生活質(zhì)量及幸福感。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujuba Mil1.var。spinosa (Bunge) Huex H.F.Chou）的干燥成熟種子[2]，具有補(bǔ)肝、寧心、斂汗和生津作用，臨床用于虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗、津傷口渴等癥[3]。酸棗仁在鎮(zhèn)靜、安眠、抗驚厥、降血脂等方面有很好的功效，已廣泛應(yīng)用在藥品和保健食品中[4]。酸棗仁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其后在歷代文獻(xiàn)中均有記載，如《名醫(yī)別錄》中“酸棗仁療心煩不得眠”。實(shí)驗(yàn)表明酸棗仁能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，起到鎮(zhèn)靜、催眠的作用，能加強(qiáng)并穩(wěn)定延長(zhǎng)巴比妥類藥的催眠作用[5]。茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf.）為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，味甘淡，性平，有健脾補(bǔ)中、安心養(yǎng)生、利水滲濕的功效，我國(guó)食用茯苓已有長(zhǎng)達(dá)千年的歷史[6]。陳春霞研究證實(shí)羧甲基茯苓多糖注射液具有催眠作用，能增強(qiáng)硫噴妥鈉對(duì)小鼠中樞的抑制，使小鼠翻正反射消失持續(xù)時(shí)間顯著增長(zhǎng)，而且可以增強(qiáng)麻醉效果[7]。

五味子為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）的干燥成熟果實(shí)。五味子含有豐富的有機(jī)酸、維生素、類黃酮、植物固醇及五味子素等木酚素，能益氣強(qiáng)肝、增進(jìn)細(xì)胞排除廢物的效率，具有鎮(zhèn)靜、催眠作用[8]。

百合（lilium spp.）為百合科百合屬植物。百合干為百合的干燥肉質(zhì)鱗葉，具有解毒、養(yǎng)陰潤(rùn)肺、理脾健胃、寧心安神等功效[9]。所選材料酸棗仁、茯苓、百合與五味子均是藥食兩用的材料。

目前，促睡眠產(chǎn)品主要是中藥復(fù)方口服液[10]，藥食兩用的促睡眠酸乳未見報(bào)道。酸乳因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味獨(dú)特受到普遍歡迎。本試驗(yàn)的目的是獲得酸棗仁和茯苓、五味子、百合干的提取物，添加到酸乳中制備促睡眠酸乳，然后，通過動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)其促睡眠功能，為促睡眠酸乳的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

保加利亞桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus），西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保存；牛奶（蛋白質(zhì)3.04±0.16% ，脂肪3.26±0.10% ，糖4.41±0.13% ），購(gòu)于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)；酸棗仁、茯苓，五味子，百合干購(gòu)于醫(yī)藥超市；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量20～25 g。生產(chǎn)許可編號(hào)為SCXK (陜) 2014-002，實(shí)驗(yàn)許可編號(hào)為SYXK (陜) 2004-001。小白鼠和飼料均購(gòu)自購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼料為標(biāo)準(zhǔn)的小鼠全價(jià)顆粒飼料。試驗(yàn)期間，室溫22℃+2℃，相對(duì)濕度為55% ～68% 。

1.2 儀器設(shè)備

L5紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PB-10 p H計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SB-5200DT超聲清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；YX-DHS-II隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸棗仁提取物提取方法比較試驗(yàn)

（1）水提法：選擇顏色、形態(tài)正常的酸棗仁，炒至鼓起，色微變深，碾碎，加入10倍量的純凈水，浸泡30 min，90℃加熱提取30 min后用濾布過濾，于濾渣中加10倍量的純凈水重復(fù)提取30 min，合并濾液，50℃真空濃縮到相當(dāng)于原藥1 g/mL，即得酸棗仁提取物。

（2）醇提法：將微炒的酸棗仁碾碎，加入8倍量體積分?jǐn)?shù)80% 的食用酒精，回流提取1 h，濾布過濾，于濾渣中再加8倍量的食用酒精回流1 h，過濾，合并濾液，真空濃縮至1 g/mL，即得酸棗仁提取物。

牛乳中分別添加上述兩種方法提取的酸棗仁提取物，參照陳文碩等[11]的方法制作酸乳樣品，比較酸乳的感官品質(zhì)，以確定酸棗仁適宜的提取方法。

1.3.2 促睡眠酸乳的制備

（1）茯苓、五味子與百合干提取物的制備。分別選擇顏色、形態(tài)正常，干爽的茯苓、五味子與百合干，其中茯苓需切碎如大豆粒大小，然后分別加入10倍量的純凈水，室溫 (20～25℃) 浸泡30 min，參照酸棗仁水提物的制備方法制備茯苓、五味子與百合干提取物[8-9]。

（2）促睡眠酸乳配方確定。參照陳文碩等[11]的方法，配料時(shí)加入酸棗仁和或茯苓、五味子、百合干混合提取物（茯苓、五味子與百合干的質(zhì)量比為 (1∶1∶1）制備促睡眠酸乳。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和有關(guān)資料[11]在確保功能的前提下設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表（見表1），獲得促睡眠酸乳的配方。

表1 促睡眠酸乳配方的正交試驗(yàn)的因素與水平

1.3.3 感官評(píng)定方法

感官評(píng)定由有品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的老師和同學(xué)共10人組成，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括色澤、滋味和氣味及組織狀態(tài)[12]。

1.3.4 酸度測(cè)定

按照GB 5413.34-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度測(cè)定》進(jìn)行[13]。

1.3.5 促睡眠酸乳功能評(píng)價(jià)

購(gòu)買昆明小鼠60只，小鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，剔除個(gè)體質(zhì)量異常者，選取50只隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ共5組，每組10只，雌雄各半，分別標(biāo)號(hào)、稱重，試驗(yàn)前小鼠個(gè)體質(zhì)量差異不顯著。其中Ⅰ組為生理鹽水對(duì)照組，灌胃生理鹽水；Ⅱ組為普通酸乳對(duì)照組，灌胃普通酸乳；Ⅲ組為普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物組，灌胃普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物；Ⅳ、Ⅴ組為普通酸乳+酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物組，即促睡眠酸乳組，分為低、高兩個(gè)劑量組。

根據(jù)人和小鼠的體表面積比例計(jì)算Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組灌胃促睡眠酸乳的量分別為12.5、12.5和25.1 g/kg，分別為人體臨床等效劑量的2倍和4倍[14]，普通酸乳組灌胃普通酸乳12.5 g/kg，Ⅱ-Ⅳ組用生理鹽水按照成品酸乳：灌胃酸乳=1:1.6稀釋，Ⅴ組旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃濃縮為原體積的0.8倍，使Ⅰ-Ⅳ組灌胃劑量均為0.2 mL/10g小鼠體質(zhì)量。試驗(yàn)開始后對(duì)每只小鼠每周稱重1次，調(diào)整灌胃劑量，連續(xù)灌胃14 d。于末次灌胃30 min后每只小鼠按體質(zhì)量腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉。各組以灌胃后小鼠翻正反射消失為入睡指標(biāo)，計(jì)算入睡時(shí)間，以其翻正反射恢復(fù)為小鼠的蘇醒指標(biāo)，記錄各組小鼠的睡眠時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS22.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁提取物提取方法比較

由表3可知，添加醇提法酸棗仁提取物所制備的酸乳顏色較深，口感粗糙。而添加水提法酸棗仁提取物生產(chǎn)出的酸乳風(fēng)味、色澤和口感均比較好，綜合考慮，酸棗仁有效成分適宜提取方法為水提法。

2.2 促睡眠酸乳配方確定

以酸棗仁提取物添加量、茯苓-五味子-百合干混合提取物添加量、穩(wěn)定劑添加量、菌種接種量為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以酸度和感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，確定促睡眠酸乳的配方，結(jié)果見表4。

由表4極差分析可知，各因素對(duì)酸乳產(chǎn)酸影響的大小順序依次為：茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞菌種接種量＞酸棗仁提取物添加量＞穩(wěn)定劑添加量。由處理2、3、5、6、8、9得知，隨著茯苓、五味子、百合干混合提取物量的增加，酸度明顯下降。由處理1、2、7、8可以看出，隨接種量的加大，酸度明顯加強(qiáng)。各因素對(duì)感官品質(zhì)影響的大小順序?yàn)椋核釛椚侍崛∥锾砑恿浚窘臃N量＞茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞穩(wěn)定劑添加量，酸棗仁提取物添加量對(duì)產(chǎn)品口感影響最大。綜合產(chǎn)酸能力和感官評(píng)價(jià)得出最佳工藝水平組合為A2B1C2D3。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析，可知最佳工藝為：酸棗仁提取物添加量10.0% ，茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量7.0% ，接種量4.0% ，穩(wěn)定劑添加量0.2% 。據(jù)此工藝生產(chǎn)的促睡眠酸乳，凝固性好，無(wú)乳清析出，酸味柔和，酸甜適口，風(fēng)味良好。

表4 促睡眠酸乳工藝配方的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 促睡眠酸乳功能評(píng)價(jià)

2.3.1 促睡眠酸乳對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表5顯示，各組小鼠的初始體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即小鼠的初始體質(zhì)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果幾乎沒有影響；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠的體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05），即試驗(yàn)樣品對(duì)小鼠組間體質(zhì)量增長(zhǎng)基本無(wú)影響。但從表5可以看出，與生理鹽水對(duì)照組 (I) 相比，普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) 、普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠試驗(yàn)?zāi)┢诘捏w質(zhì)量有減輕趨勢(shì)，雖然差異不顯著（P＞0.05），至少說(shuō)明飲用促睡眠酸乳不會(huì)增肥。

2.3.2 促睡眠酸乳對(duì)小鼠睡眠質(zhì)量的影響

由表6可知，生理鹽水對(duì)照組 (Ⅰ) 小鼠的入睡時(shí)間與普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) 和普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 相比差異不顯著（P＞0.05），但與促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異極顯著（P＜0.01）。促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠的入睡時(shí)間與普通酸乳組 (Ⅱ) 相比差異顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）。就入睡時(shí)間來(lái)說(shuō)，普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) ＜普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) ＜生理鹽水對(duì)照組 (Ⅰ) ，但差異不顯著，說(shuō)明普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和普通酸乳組 (Ⅱ) 均有一定的促進(jìn)睡眠的作用，普通酸乳與茯苓、五味子、百合干混合提取物有一定的協(xié)同作用；普通酸乳與酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的協(xié)同作用，并呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，低、高劑量組的促睡眠酸乳能顯著減少小鼠的入睡時(shí)間，因此具有良好的促睡眠作用。

由表6亦可知，生理鹽水對(duì)照組 (Ⅰ) 小鼠的睡眠時(shí)間與普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) 相比差異不顯著（P>0.05），但與普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) 的睡眠時(shí)間與普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 相比差異顯著（P<0.05），與促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異極顯著（P<0.01）。普通酸乳對(duì)照組 (Ⅱ) 小鼠的睡眠時(shí)間稍高于生理鹽水對(duì)照組 (Ⅰ) ，但差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明普通酸乳也有一定的促進(jìn)睡眠的作用。普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 能顯著延長(zhǎng)小鼠的睡眠時(shí)間，說(shuō)明普通酸乳與茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有協(xié)同作用。促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 能極顯著延長(zhǎng)小鼠的睡眠時(shí)間，說(shuō)明酸乳與酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的協(xié)同作用，促睡眠酸乳具有顯著的促睡眠作用。

表5 促睡眠酸乳對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表6 促睡眠酸乳對(duì)小鼠睡眠質(zhì)量的影響

失眠可以從形態(tài)的變化及延長(zhǎng)戊巴比妥類或其他鎮(zhèn)靜藥的睡眠時(shí)間上反映出來(lái)。失眠主要是由高級(jí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致，表現(xiàn)為大腦皮層的抑制轉(zhuǎn)換與興奮功能失調(diào)。1969年，Arpa等[15]提出5-羥色胺（5-HT）失眠學(xué)說(shuō)，得到廣泛認(rèn)可。后來(lái)Vgontzas等[16]通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，失眠可能與下丘腦-垂體-腎上腺軸的晝夜激活有關(guān)。蔡定芳等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)大鼠注射皮質(zhì)酮后下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸被抑制的同時(shí)下丘腦單胺類遞質(zhì)含量升高，與其有關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT等可基本反映這一過程。本試驗(yàn)結(jié)果與該理論一致，從以下幾方面分述。

酸棗仁的化學(xué)成分豐富，目前已從酸棗仁中分離得到達(dá)瑪烷型三萜皂苷、黃酮類化合物、生物堿等活性化學(xué)成分[18]。Jiang等[19]對(duì)酸棗仁中的皂苷、黃酮和多糖進(jìn)行了鎮(zhèn)靜催眠作用的比較，發(fā)現(xiàn)黃酮和皂苷均能顯著縮短小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，降低小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力，并延長(zhǎng)巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷（主要是酸棗仁皂苷A和B）和酸棗仁黃酮（主要是斯皮諾素）是酸棗仁中發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的活性物質(zhì)。祝凌麗[21]也通過研究發(fā)現(xiàn)斯皮諾素是通過5-羥色胺系統(tǒng)，并作為5-HT1A受體阻斷劑，作用于突觸前和突觸后5-HT1A受體，從而增強(qiáng)戊巴比妥的催眠作用。

茯苓中含有茯苓多糖成分具有鎮(zhèn)靜作用[22]。茯苓有效成分的小鼠試驗(yàn)表明，茯苓多糖對(duì)小鼠中樞神經(jīng)可以產(chǎn)生抑制作用，從而延長(zhǎng)麻醉時(shí)間[23]。張榮標(biāo)等[24]通過研究復(fù)方酸棗仁茯苓口服液對(duì)小鼠睡眠的改善作用，發(fā)現(xiàn)復(fù)方酸棗仁茯苓口服液對(duì)小鼠睡眠具有改善作用，其中酸棗仁與茯苓成分具有協(xié)同作用，與本研究結(jié)果一致。

五味子具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。有研究表明，五味子提取物能減少小鼠自主活動(dòng)，延長(zhǎng)巴比妥睡眠時(shí)間、抑制動(dòng)物攻擊行為，對(duì)抗電休克和化學(xué)性驚厥，作用與安定藥相似[25]。王春梅[26]等通過研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖能明顯減少小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的只數(shù)，縮短小鼠睡眠潛伏期和顯著延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間，表明北五味子多糖具有鎮(zhèn)定、催眠及抗焦慮作用。

百合主要活性物質(zhì)為甾體皂苷類、酚酸甘油脂類和生物堿類等，多用于治療虛煩驚悸、失眠多夢(mèng)、精神恍惚[27]。Wang等[28]通過相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)百合的鎮(zhèn)靜催眠作用與其總皂苷及薯蕷皂苷具有明顯的相關(guān)性。李峰杰等[29]通過研究發(fā)現(xiàn)百合還能夠顯著縮短戊巴比妥鈉及氯苯丙氨酸致失眠模型動(dòng)物的睡眠潛伏期，表明百合具有較好的鎮(zhèn)靜催眠作用。

牛乳中含有較多的色氨酸和微量的嗎啡物質(zhì)[30]，這些物質(zhì)都有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用[30]，特別是色氨酸，它是大腦合成5-羥色胺的主要原料[32]。5-羥色胺是大腦神經(jīng)細(xì)胞分泌出一種使人欲睡的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)大腦睡眠起著關(guān)鍵作用，且無(wú)任何副作用，因此喝牛奶有利于人們的休息和睡眠[33]。將牛乳加工成酸乳后，由于乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)有降解作用，色氨酸含量明顯增加，還會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)睡眠的活性肽[34]。Sawada等[35]對(duì)參加尸體解剖課程的健康男性研究表明，服用乳酸桿菌4周可顯著改善其焦慮、抑郁情緒和整體睡眠質(zhì)量。而且酸乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于消毒牛乳或滅菌生乳，B族維生素可增加10% ～15% 。因此可以說(shuō)明酸乳比牛奶具有更好的促進(jìn)睡眠作用。因此，酸乳與酸棗仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有協(xié)同作用。

3 結(jié)論

利用酸棗仁、茯苓、五味子、百合干提取物與牛乳為主要原料，經(jīng)發(fā)酵制得一種凝固性好、無(wú)乳清析出、酸味柔和、酸甜適口、風(fēng)味良好的促睡眠酸乳，其中酸棗仁提取物、茯苓+五味子+百合干混合提取物、穩(wěn)定劑最佳添加量分別為10.0% 、7.0% 、0.2% ，質(zhì)量比為1∶1的保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的最佳接種量為4.0% 。同時(shí)就促睡眠酸乳對(duì)小鼠睡眠質(zhì)量影響的研究表明，酸乳與酸棗仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有良好的協(xié)同作用，并呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。促睡眠酸乳組具有鎮(zhèn)靜催眠作用，可以滿足人們對(duì)高效，無(wú)毒副作用的新型功能性乳制品的需要,市場(chǎng)前景廣闊。