蛋白酶對(duì)黃酒發(fā)酵的影響及揮發(fā)性成分分析

陳 通，芮鴻飛，葉林林，胡 浩，郭 儉，劉興泉，

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 311300；2.杭州市臨安區(qū)疾病預(yù)防控制中心，浙江杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 311300）

黃酒是世界三大古酒之一[1]，是以麥曲為主要糖化劑，經(jīng)長(zhǎng)期陶壇陳釀而成的風(fēng)味飲品，獨(dú)特的釀造工藝造就了黃酒獨(dú)有的風(fēng)味特征[2-3]。麥曲是黃酒發(fā)酵中最常用的糖化發(fā)酵劑，除積累了根霉、米曲霉、細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物外，還富含糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等酶類(lèi)[4]。在黃酒釀造過(guò)程中，麥曲中的各種酶系將原料中淀粉、蛋白質(zhì)等降解為酵母及其他微生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)為黃酒增香[5]。

隨著釀酒工業(yè)的發(fā)展，酶制劑廣泛應(yīng)用于發(fā)酵酒的生產(chǎn)中。啤酒中，酶制劑主要用于啤酒澄清[6]；葡萄酒中，主要集中于增香劑的研發(fā)[7-9]；黃酒同為三大古酒，主要集中在酸性蛋白酶的研究上。酸性蛋白酶能加速蛋白質(zhì)的水解，增加可利用的氮源，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)并有效控制乳酸菌等雜菌的繁殖，從而減少了酸、醛等副產(chǎn)物的產(chǎn)生[10]；且黃酒醪液中酒精度、氨基酸態(tài)氮含量與酸性蛋白酶的添加量成正比[11-12]。蛋白酶促進(jìn)游離氨基酸的釋放,提高黃酒揮發(fā)性成分的形成，顯著改變黃酒風(fēng)味組成[13-14]。

為進(jìn)一步探究蛋白酶在黃酒生產(chǎn)中應(yīng)用的可行性，本試驗(yàn)選取3 種食品級(jí)蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶），探討蛋白酶的添加對(duì)黃酒發(fā)酵及揮發(fā)性成分的影響，為提升黃酒風(fēng)味品質(zhì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米，安徽南陵米業(yè)有限公司；黃酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；麥曲，紹興古越龍山黃酒股份有限公司；風(fēng)味蛋白酶（20000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（120000 U/g），北京索萊寶科技有限公司；2-辛醇（純度＞99.8%），美國(guó)sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：QP-2010 GC/MS，日本島津公司，配RTX-WAX 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm）；100 μm PDMS 萃取頭及SPME手動(dòng)柄，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃酒釀造工藝流程

1.3.2 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

糯米∶水∶麥曲∶酵母=500∶500∶50∶1，以風(fēng)味蛋白酶添加量100 mg/L[15]為基準(zhǔn)，控制3 種蛋白酶的酶活當(dāng)量相同，中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶的添加量分別為33.3 mg/L、16.7 mg/L。

蛋白酶經(jīng)50 ℃活化30 min 后，與黃酒活性干酵母混勻后接種于酒壇；30 ℃有氧糖化3 d，每12 h開(kāi)耙1 次；前酵（4～7 d，15 ℃密封發(fā)酵，每48 h 開(kāi)耙1 次）；中酵（8～12 d，15 ℃密封發(fā)酵，每3 d 開(kāi)耙1 次，）；后酵（13～34 d，15 ℃密封發(fā)酵），發(fā)酵結(jié)束后90 ℃滅菌30 min，灌裝待測(cè)。

1.3.3 黃酒常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

總糖、總酸、酒精度的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2018《黃酒》。

1.3.4 黃酒揮發(fā)性成分的測(cè)定[16]

1.3.4.1 樣品處理

PDMS 萃取頭使用前先在氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃活化30 min；20 mL 頂空瓶中準(zhǔn)確加入5 mL黃酒樣品、5 mL 去離子水和20 μL 內(nèi)標(biāo)2-辛醇（1.143 mg/mL 乙醇溶液），加蓋密封墊和鋁帽，50 ℃預(yù)熱5 min 后，PDMS 萃取頭萃取吸附30 min，進(jìn)樣口250 ℃條件下GC解析15 min。

1.3.4.2 色譜條件

GC 條件：色譜柱為RTX-WAX 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.35 mm×0.25 μm)，以氦氣(99.999%)為載氣，恒定流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；柱溫采用程序升溫，初始溫度為40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min 升溫到120 ℃，保持5 min，再以3 ℃/min升溫到190 ℃，保持5 min。

MS 條件：EI 源，電子能量70 eV，全掃描模式采集數(shù)據(jù)，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍為40～500 u，溶劑切除3 min。

1.3.4.3 定性定量方法

采用NIST08 和NIST08s 標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)進(jìn)行檢索，以匹配度大于80%作為檢索結(jié)果；以檢測(cè)出物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)2-辛醇峰面積的比值來(lái)確定揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。按照以下公式計(jì)算各種揮發(fā)性香氣成分相對(duì)含量：

其中：Ai——各種香氣成分對(duì)應(yīng)峰面積；

Aj——內(nèi)標(biāo)峰面積。

1.3.5 酵母菌的計(jì)數(shù)

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用TBtools 和GraphPad 8.0 軟件作圖，每組試驗(yàn)設(shè)置3 組重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means ±SD）表示，在p ＜0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的添加對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程的影響

測(cè)定了黃酒發(fā)酵過(guò)程中總糖和酵母菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，添加風(fēng)味蛋白酶能顯著提高總糖的利用率，而復(fù)合蛋白酶的添加使總糖的消耗速率下降。處理組與對(duì)照組的酵母菌數(shù)變化趨勢(shì)相似，在發(fā)酵第7 天達(dá)到最高值，在第16 天趨于穩(wěn)定。其中風(fēng)味蛋白酶顯著地促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)，最高峰值達(dá)3.18×108cfu/mL，比對(duì)照組上升了15.7%，并在后期穩(wěn)定時(shí)保持較高的水平，為1.68×108cfu/mL。風(fēng)味蛋白酶促進(jìn)糯米中大分子的蛋白質(zhì)水解成小分子肽和游離氨基酸，更易于被酵母吸收利用[17]，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，并提高酵母細(xì)胞對(duì)糖的轉(zhuǎn)化速率[18]。酵母可利用氮源的缺乏或過(guò)量都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且氮源水平與細(xì)胞生長(zhǎng)速度呈正相關(guān)[19-21]。

黃酒總糖、總酸、酒精度和氨基酸態(tài)氮含量結(jié)果見(jiàn)圖2。酒精度是基于醪液發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞所轉(zhuǎn)化的糖總量。由圖2 可知，添加風(fēng)味蛋白酶所釀黃酒的氨基酸態(tài)氮與酒精度最高，總糖、總酸含量最低。其中氨基酸態(tài)氮含量為0.43 g/L，酒精度為15.1%vol，較對(duì)照組分別上升了30.3%、5.6%，結(jié)合總糖含量變化規(guī)律（圖1a），說(shuō)明風(fēng)味蛋白酶的添加促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，使得更多的糖轉(zhuǎn)化為酒精，與蔡小云的研究結(jié)果相似[22]。添加風(fēng)味蛋白酶的黃酒總酸為6.6 g/L，較對(duì)照組下降了8.3%，而添加中性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的黃酒總酸與對(duì)照組差異不顯著。

表1 添加蛋白酶黃酒揮發(fā)性成分的分析

2.2 蛋白酶的添加對(duì)黃酒揮發(fā)性成分的影響

黃酒有著獨(dú)特的香氣特征，其中醇、酸、酯類(lèi)物質(zhì)是主要的香氣物質(zhì)，起香氣骨架的作用[23-25]。采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（HSSPME-GC/MS）測(cè)定了黃酒揮發(fā)性物質(zhì)，篩選了32種主要的揮發(fā)性成分（14 種酯、10 種醇、4 種酸和4種其他物質(zhì)）進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，添加蛋白酶顯著促進(jìn)了高級(jí)醇和酯的合成，抑制了酸的合成。其中，添加風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶對(duì)總酯的促進(jìn)率分別為97.6%、155.1%、261.0%。蛋白酶增加了醪液中的氨基酸態(tài)氮含量（見(jiàn)圖2b），促進(jìn)了酵母細(xì)胞對(duì)氮源的吸收利用，從而增強(qiáng)了風(fēng)味物質(zhì)的形成。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，提高醪液中氮源水平可促進(jìn)酯的形成[26-27]。

2.3 黃酒揮發(fā)性成分的主成分及聚類(lèi)熱圖分析

對(duì)表1 中32 種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分及聚類(lèi)熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。主成分分析表明不同酒樣與風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系。圖3a 顯示風(fēng)味物質(zhì)分布在4 個(gè)象限中，其中肉豆蔻酸乙酯（r=0.999）、琥珀酸二乙酯（r=0.992）、己酸乙酯（r=0.990）、乙酸異戊酯（r=0.987）和乙酸乙酯（r=0.982）等物質(zhì)集中分布在第一象限，均對(duì)第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）有較大的正向影響。結(jié)合圖3b 表明這類(lèi)物質(zhì)與添加風(fēng)味蛋白酶的黃酒有較大的相關(guān)性，說(shuō)明風(fēng)味蛋白酶能促進(jìn)黃酒中肉豆蔻酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯等物質(zhì)的生成并改善黃酒的風(fēng)味品質(zhì)。

表2 10種黃酒揮發(fā)性成分香氣活力值的評(píng)價(jià)

聚類(lèi)熱圖結(jié)果見(jiàn)圖3c，不同顏色表示各香氣化合物的含量差異，紅色表示含量高，綠色表示含量低。基于香氣化合物含量進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果顯示，32種化合物在不同酒樣中的分布可以聚為4 類(lèi)。其中化合物含量C 類(lèi)＞D 類(lèi)＞A 類(lèi)＞B 類(lèi)。在不同黃酒樣品中差異最顯著的是C 類(lèi)化合物，包括異戊醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丁酸乙酯和棕櫚酸乙酯，與對(duì)照組相比，蛋白酶的添加顯著提高了這些化合物的含量。

2.4 黃酒香氣貢獻(xiàn)率的分析

為了進(jìn)一步比較各香氣化合物對(duì)黃酒整體香氣的貢獻(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)[28-33]報(bào)道中各香氣化合物的香氣描述及香氣閾值濃度，計(jì)算各香氣化合物在黃酒中的OAVs，結(jié)果見(jiàn)表2。丁酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯等化合物具有濃郁的水果香，添加蛋白酶后其OAVs＞1，表明這些香氣物質(zhì)對(duì)黃酒香氣特征具有明顯的貢獻(xiàn)。其中風(fēng)味蛋白酶對(duì)乙酸異戊酯、己酸乙酯和癸醛的貢獻(xiàn)率促進(jìn)效果最好，分別是對(duì)照組的5.6 倍、1.3 倍、1.5 倍；復(fù)合蛋白酶對(duì)丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯的貢獻(xiàn)率提升最顯著，分別是對(duì)照組的30.2倍、3.31倍。

4-乙基愈創(chuàng)木酚具有典型的辛辣、刺激的煙氣味，是構(gòu)成我國(guó)黃酒“煙氣香”風(fēng)味特征的重要香氣化合物[34]。黃酒中酚類(lèi)化合物可能主要來(lái)自植物原料中木質(zhì)素及其他植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[35]。中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶增加了4-乙基愈創(chuàng)木酚在黃酒中的貢獻(xiàn)率，分別是對(duì)照組的1.2 倍、1.3 倍，而風(fēng)味蛋白酶抑制了4-乙基愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生，消除了辛辣、刺激氣味，營(yíng)造了濃郁協(xié)調(diào)的香氣氛圍。

3 結(jié)論

蛋白酶的添加顯著影響黃酒發(fā)酵，其中風(fēng)味蛋白酶最顯著。與對(duì)照組相比，風(fēng)味蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)分解，氨基酸態(tài)氮含量增加了30.3%，酵母菌數(shù)上升了15.7%，酒精度增加了5.6%，總酸下降了8.3%；中性蛋白酶的促進(jìn)效果比不上風(fēng)味蛋白酶；而復(fù)合蛋白酶提高了總酸含量，導(dǎo)致黃酒酸敗。

蛋白酶的添加可顯著促進(jìn)高級(jí)醇和酯的形成。通過(guò)主成分與聚類(lèi)熱圖分析發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味蛋白酶促進(jìn)β-苯乙醇、異戊醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯等香氣物質(zhì)的生成，這類(lèi)物質(zhì)集中分布在第一象限，對(duì)PC1、PC2 均有正向作用。風(fēng)味蛋白酶提高了異戊醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯等物質(zhì)對(duì)黃酒整體香氣的貢獻(xiàn)（OAVs 增大），降低了辛辣、刺激氣味。而添加中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的黃酒風(fēng)味比不上對(duì)照組。3 種蛋白酶中，風(fēng)味蛋白酶的添加能顯著改善黃酒風(fēng)味品質(zhì)，為提升黃酒風(fēng)味品質(zhì)的技術(shù)提供參考。