多種抑制劑對上海青吸收土壤中鄰苯二甲酸二丁酯的影響

徐文君 程江峰 余向陽 萬群

摘要：通過添加各種離子通道抑制劑、水通道抑制劑及代謝抑制劑到上海青（Brassica rapa var. chinensis）培養(yǎng)液中，研究植株對水溶液中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的吸收機制。結(jié)果表明，添加水通道抑制劑、鉀離子通道抑制劑、鈣離子通道抑制劑、非選擇性陽離子通道抑制劑以及陰離子通道抑制劑對上海青吸收DBP的抑制程度并不顯著，添加代謝抑制劑2，4-二硝基苯酚（DNP）、碳酰氰間氯苯腙（CCCP），對上海青吸收DBP的抑制程度降低了69.6%、69.1%，使上海青對DBP的富集系數(shù)降低了77.4%、95.2%。說明該水培條件下DBP進(jìn)入上海青體內(nèi)并非通過不耗能的各種離子通道或水通道，而是一個依賴能量代謝的過程。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）;上海青;富集系數(shù);通道抑制劑;代謝抑制劑

中圖分類號： X173文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0272-05

收稿日期：2019-03-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31772197、31601660）。

作者簡介：徐文君（1994—），男，山東青島人，碩士研究生，主要從事微生物、植物與環(huán)境污染物塑化劑研究。E-mail：741056894@qq.com。

通信作者：余向陽，博士，研究員，主要研究方向為污染物殘留代謝調(diào)控及其機理和農(nóng)藥環(huán)境行為及生態(tài)毒理評估。E-mail：yuxy@jaas.ac.cn。

塑化劑，通常也叫增塑劑，是一種在塑料加工過程中被廣泛使用的高分子材料助劑，它可以使塑料的柔韌性增強[1]。鄰苯二甲酸酯（PAEs），又稱酞酸酯，是塑化劑中使用最頻繁的一類物質(zhì)，其中常見的有以鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）以及鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）為首的大約30種物質(zhì)[2]。它們的用途廣泛，涉及塑料、橡膠、黏合劑、保鮮膜、化妝品、醫(yī)療器械等領(lǐng)域[3-4]。但是由于PAEs與塑料制品間并非以共價鍵相連，并不穩(wěn)定，所以會非常容易的擴散到外界環(huán)境中去[5]。人體能通過皮膚吸收、呼吸、飲食等多種途徑吸收環(huán)境中的PAEs[6]，它被認(rèn)為是環(huán)境荷爾蒙，具有類雌激素作用，可嚴(yán)重干擾人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響生殖系統(tǒng)，甚至?xí)斐苫蚨拘訹7-8]。因此，控制環(huán)境中的PAEs污染是一個亟待解決的重要問題。

近年來，隨著塑料大棚、地膜栽培技術(shù)的廣泛使用，農(nóng)田土壤中已經(jīng)多次被檢出含有PAEs，而土壤中的PAEs最終會以各種形式進(jìn)入作物中[9]，對作物的質(zhì)量及產(chǎn)量產(chǎn)生極大影響，土壤與作物已經(jīng)遭受到PAEs的嚴(yán)重污染[10]。目前針對土壤-作物系統(tǒng)中PAEs的治理方法有多種，常見的有以自然降解和生物降解手段降低土壤中PAEs的含量，其中自然降解包括水解和光解，但效果并不理想，無法做到完全礦化[11];微生物降解恰恰相反，因為具有高效快速、降解徹底等優(yōu)點，已成為降解環(huán)境中PAEs污染的主要途徑[12-13]。此外，國內(nèi)外也有學(xué)者利用其他途徑解決這一問題。文勤亮通過向DEHP污染土壤中添加氧化劑，加速對DEHP的降解[14]。Wu等通過將冬瓜與其他蔬菜進(jìn)行套種，利用冬瓜大量吸收土壤中的DEHP來降低其他蔬菜的DEHP含量[15]。但以上方法都具有各自的局限性及弊端，無法大規(guī)模適用，因此針對目前土壤-作物系統(tǒng)中的PAEs污染，選擇一種全面、合適的治理方法顯得尤為重要。

降低作物對污染物吸收的方法可以作為修復(fù)土壤-作物系統(tǒng)中PAEs污染的另一種途徑。植株吸收、累積PAEs的能力受多種因素影響，目前認(rèn)為宏觀影響因素主要有土壤類型、植株類型、PAEs污染程度、生長情況等[16]。從吸收途徑上來講，植物對污染物的吸收主要通過葉片氣孔的蒸騰作用以及植物根部的主動吸附和被動吸附，并且在主動吸收過程中經(jīng)常需要三磷酸腺苷（ATP）的參與[17]。葉片吸收的主要是空氣中的蒸汽態(tài)污染物，根系吸收才是植株吸收土壤中污染物的主要途徑[18]。根系吸收通道包括水通道以及離子通道等，水通道蛋白在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運水分子時表現(xiàn)出特異性，有助于維持機體水平衡;離子通道在植物各種生理活動中具有重要作用，它能夠幫助植物實現(xiàn)的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、葉片運動以及氣孔開閉等。因此，針對植物對污染物的吸收方式，以特定手段進(jìn)行抑制或阻斷將可能實現(xiàn)對土壤-作物系統(tǒng)中PAEs污染的治理。

本研究以添加抑制劑來降低作物對土壤中PAEs的吸收為思路，選擇PAEs中經(jīng)常被大量檢出的成分鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和常見作物上海青為研究對象，通過向含有DBP的植株水培營養(yǎng)液中分別添加水通道抑制劑、離子通道抑制劑、代謝抑制劑，觀察在DBP污染營養(yǎng)液中生長24 h的上海青在各類抑制劑影響下對DBP的吸收情況，計算植株在各種抑制劑影響下對DBP的富集系數(shù)（BCF），以期從中找到合適的抑制劑來降低上海青對DBP的吸收，為治理土壤-作物系統(tǒng)中的PAEs污染提供一種新的思路和方法。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試材料

上海青青菜種子，購自南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司。

1.1.2?主要試劑

鄰苯二甲酸二丁酯，上海安普實驗科技股份有限公司，含量>98.5%;色譜純乙腈，德國默克集團(tuán);乙酸乙酯（C4H8O2），德國默克集團(tuán);氯化鈉（NaCl）氯化鋇（BaCl2）、氯化鈣（CaCl2），上海久億化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鎂（MgSO4），成都市科隆化學(xué)品有限公司;N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB），天津博納艾杰爾科技有限公司;甘油（Glycerol），廣州賽國生物科技有限公司;氯化汞（HgCl2），山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;9-CA，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司;4，4-二異硫氰酸基-2，2- 二苯乙烯磺酸二鈉（DIDS），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;氯化四乙胺、2，4-二硝基苯酚（DNP），酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司;乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、氯化鈷（CoCl2）、碳酸氯間氯苯腙（CCCP），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。以上抑制劑利用合適的的溶劑溶解成合適的濃度低溫保存待用。

2.3?添加代謝抑制劑后上海青對DBP的吸收情況

代謝抑制劑能夠抑制機體產(chǎn)生ATP，從而抑制需要能量的代謝的進(jìn)行。從試驗結(jié)果（圖3）可以看出，DNP、CCCP對上海青吸收DBP的抑制程度分別為69.6%、69.1%，DNP、CCCP的添加分別使上海青對DBP的富集系數(shù)降低了77.4%、95.2%。2種代謝抑制劑都能夠極顯著地抑制上海青對DBP的吸收（P<0.01），且2種代謝抑制劑的添加極顯著降低了上海青對DBP的富集系數(shù)（P<0.01）。表明代謝抑制劑極顯著地抑制了上海青根系對DBP的吸收，同時說明在本研究中的水培條件下上海青吸收DBP是一個依賴能量代謝的過程。

3?討論與結(jié)論

20世紀(jì)30年代，樟腦球因為氣味大、易揮發(fā)等不足而被PAEs所取代[21]，并且開始被大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[3]，目前PAEs已經(jīng)被認(rèn)為是第2個全球性多氯聯(lián)苯（PCB）污染物[22]。為了防止PAEs的過度使用，我國于2008年開始實行“限塑令”，然而效果并不理想，至2014年P(guān)AEs產(chǎn)量已經(jīng)高達(dá)580萬t，并且以每年3.9%的速度持續(xù)增長至今[23]。而我國農(nóng)田土壤也被檢測到PAEs嚴(yán)重超標(biāo)，土 壤- 作物系統(tǒng)在PAEs的污染下已經(jīng)岌岌可危。

利用微生物降解土壤中的PAEs，以緩解作物對其吸收是目前治理土壤-作物系統(tǒng)中PAEs的主要方法，目前已經(jīng)有大量的降解菌在污染土壤、污水底泥等中被分離出來。金德才等分離的JDC-11能夠在DBP濃度為1 000 mg/L的條件下24 h內(nèi)完全降解DPB[24]。Feng等從植物中分離到1株能在5 d內(nèi)對DBP的降解率達(dá)到82.5%的內(nèi)生菌YJB3[25]。

通過添加通道抑制劑來抑制植物對污染物的吸收的方法在近幾年被大量運用。施翔研究發(fā)現(xiàn)，添加鈣離子通道抑制劑和蛋白合成抑制劑后，鹽膚木根系吸收的鉛顯著減少[26]。張福祎發(fā)現(xiàn)，蘋果酸、檸檬酸、草酸的添加以及鉀離子的存在可顯著促進(jìn)單一抑制劑對水稻吸收鉈的抑制作用[27]。本研究結(jié)果表明，上海青對DBP的吸收并沒有受到各種通道抑制劑的影響，說明在本研究中的水培條件下上海青對DBP的吸收并不依賴于這些通道。

DNP和CCCP是非常典型的解偶聯(lián)劑，它們能夠使呼吸鏈中電子傳遞所產(chǎn)生的能量不能用于二磷酸腺苷（ADP）的磷酸化，而只能以熱的形式散發(fā)，進(jìn)而抑制ATP的形成，從而影響需要ATP參與的各種代謝。華海霞發(fā)現(xiàn)，添加DNP對水稻在硅濃度較低的培養(yǎng)液中吸收硅抑制效果比在硅濃度較高的培養(yǎng)液中更明顯[28]。馬恒亮發(fā)現(xiàn)，添加DNP對培養(yǎng)液中吸收硅小麥吸收苯丙氨酸（PHE）有顯著的抑制作用，且抑制作用隨其濃度的增大而增強[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，DNP、CCCP對上海青吸收DBP的抑制作用極強，并且可以看到，使上海青對DBP的富集系數(shù)極顯著下降，說明在本研究中的培養(yǎng)條件下上海青對DBP吸收的主要途徑是需要能量的。但吸收途徑并非一成不變，不同的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致不同的吸收途徑，張聯(lián)合等發(fā)現(xiàn)，在不同的pH值條件下水稻根系吸收亞硒酸鹽的途徑并不一致[30]。關(guān)于不同培養(yǎng)條件下上海青對DBP的吸收途徑還有待進(jìn)一步研究。

治理和修復(fù)土壤-作物系統(tǒng)的PAEs污染對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全以及人類健康有極其重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，通過添加代謝抑制劑可以有效地降低上海青對土壤中DBP的吸收，結(jié)果可對PAEs污染土壤上的作物種植和植物修復(fù)提供新的研究思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃?艷，卞戰(zhàn)強，田向紅，等. 環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類化合物降解技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志，2010（7）：654-657.

[2]任?仁. 警惕鄰苯二甲酸酯污染[J]. 大學(xué)化學(xué)，2003，18（6）：33-36.

[3]Latini G. Monitoring phthalate exposure in humans[J]. Clinica Chimica Acta，2005，361（1/2）：20-29.

[4]Stales C A，Peterson D R，Parkerton T F，et al. The environmental fate of phthalate esters：a literature review[J]. Chemosphere，1997，35（4）：667-749.

[5]Abdel daiem M M，Rivera-Utrilla J，Ocampo-Pérez R，et al. Environmental impact of phthalic acid esters and their removal from water and sediments by different technologies—a review[J]. Journal of Environmental Management，2012，109：164-178.

[6]Guo Y，Kannan K. Comparative assessment of human exposure to phthalate esters from house dust in China and the United States[J]. Environmental Science & Technology，2011，45（8）：3788-3794.

[7]胡?丹. 酞酸酯暴露、神經(jīng)遞質(zhì)通路基因多態(tài)性及其交互作用與兒童注意缺陷多動障礙的關(guān)聯(lián)研究[D]. 武漢：華中科技大學(xué)，2017.

[8]聞?福. 孕婦尿液中鄰苯二甲酸酯含量與胎盤基因表達(dá)關(guān)系研究[D]. 天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2012.

[9]陳意良. DEHP高/低累積水稻品種的根際環(huán)境差異及土壤吸附研究[D]. 廣州：暨南大學(xué)，2016.

[10]Xu X R，Li X Y. Adsorption behaviour of dibutyl phthalate on marine sediments[J]. Marine Pollution Bulletin，2008，57（6/7/8/9/10/11/12）：403-408.

[11]李海濤，黃歲樑. 水環(huán)境中鄰苯二甲酸酯的遷移轉(zhuǎn)化研究[J]. 環(huán)境污染與防治，2006，28（11）：853-858.

[12]Zhao H M，Du H，F(xiàn)eng N X，et al. Biodegradation of di-n-butylphthalate and phthalic acid by a novel Providencia sp.2D and its stimulation in a compost-amended soil[J]. Biology and Fertility of Soils，2015，52（1）：65-76.

[13]Zhao H M，Du H，Lin J，et al. Complete degradation of the endocrine disruptor di-（2-ethylhexyl） phthalate by a novel Agromyces sp. MT-O strain and its application to bioremediation of contaminated soil[J]. The Science of the Total Environment，2016，562：170-178.

[14]文勤亮. 鄰苯二甲酸酯污染土壤化學(xué)氧化修復(fù)技術(shù)的初步研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[15]Wu Z，Zhang X，Wu X，et al. Uptake of di（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） by the plant Benincasa hispida and its use for lowering DEHP content of intercropped vegetables[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（22）：5220-5225.

[16]宋廣宇，代靜玉，胡?鋒. 鄰苯二甲酸酯在不同類型土壤-植物系統(tǒng)中的累積特征研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010，29（8）：1502-1508.

[17]何龍飛，劉友良，沈振國，等. 植物離子通道特征、功能、調(diào)節(jié)與分子生物學(xué)[J]. 植物學(xué)通報，1999，16（5）：517-525.

[18]戴松香，陳少良. 植物根細(xì)胞離子通道研究進(jìn)展[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27（3）：98-103.

[19]嚴(yán)煌倩，李?勇，翟麗菲，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS法快速檢測青椒中15種鄰苯二甲酸酯[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，34（2）：459-465.

[20]Barbier-Brygoo H，Vinauger M，Colcombet J，et al. Anion channels in higher plants：functional characterization，molecular structure and physiological role[J]. Biochimica et Biophysica acta，2000，1465（1/2）：199-218.

[21]Cirillo T，F(xiàn)asano E，Castaldi E，et al. Childrens exposure to di（2-ethylhexyl）phthalate and dibutylphthalate plasticizers from school meals[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（19）：10532-10538.

[22]劉?敏，林玉君，曾?鋒，等. 城區(qū)湖泊表層沉積物中鄰苯二甲酸酯的組成與分布特征[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，27（8）：1377-1383.

[23]Zhang Z M，Zhang H H，Zhang J，et al. Occurrence，distribution，and ecological risks of phthalate esters in the seawater and sediment of Changjiang River Estuary and its adjacent area[J]. The Science of the Total Environment，2018，619-620：93-102.

[24]金德才，梁任星，王洋洋，等. 一株DBP高效降解菌的篩選及其降解特性[J]. 中南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，41（1）：8-14.

[25]Feng N X，Yu J，Mo C H，et al. Biodegradation of di-n-butyl phthalate （DBP） by a novel endophytic Bacillus megaterium strain YJB3[J]. The Science of the Total Environment，2018，616/617：117-127.

[26]施?翔. 鹽膚木對鉛的吸收累積及耐性機制[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2017.

[27]張福祎. 水稻根系吸收重金屬鉈的初步機理研究[D]. 廣州：廣州大學(xué)，2018.

[28]華海霞. 水稻對硅元素吸收特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（35）：23-25.

[29]馬恒亮. 多環(huán)芳烴（菲）跨小麥根系界面的傳輸機制[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[30]張聯(lián)合，李友軍，苗艷芳，等. pH值對水稻離體根系吸收亞硒酸鹽生理機制的影響[J]. 土壤學(xué)報，2010，47（3）：523-528.