高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法測(cè)定多黏菌素類(lèi)原料藥中主成分含量

彭侃霖，宋旭琴，劉 戎，張嘉慧，周 豪，丘鏡莉，賀利民

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室，廣東 廣州 510642)

多黏菌素類(lèi)(Polymyxins)藥物是從多黏芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)中提取的非核糖體途徑合成的環(huán)多肽類(lèi)抗生素，主要包括A、B、C、D和E等品種[1]。其中，多黏菌素B主要成分為多黏菌素B1和B2；多黏菌素E(Colistin，又稱(chēng)克利斯汀)主要成分為多黏菌素E1和E2(圖1)。多黏菌素類(lèi)抗生素對(duì)革蘭氏陰性桿菌(如大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌等)具有較強(qiáng)的抗菌作用，如多黏菌素E作為獸藥廣泛應(yīng)用于治療呼吸道、腸道和泌尿系統(tǒng)感染等疾病[2]。此外，多黏菌素E還具有提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，曾被農(nóng)業(yè)部列為可在牛、豬和雞飼料中添加使用的藥物添加劑[3]。但其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛、大量和長(zhǎng)期使用，不僅具有潛在腎毒性及神經(jīng)毒性作用，還會(huì)增大細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)，危害人類(lèi)健康[4-6]。為此，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2428號(hào)公告明確規(guī)定停止多黏菌素E用于動(dòng)物促生長(zhǎng)，但保留其在動(dòng)物中的藥用功能[7]。

圖1 多黏菌素B和多黏菌素E的結(jié)構(gòu)式
Fig.1 Chemical structures of polymyxin B and polymyxin E

多黏菌素B和E均由相應(yīng)生產(chǎn)菌發(fā)酵后提取制備，組分復(fù)雜，對(duì)其產(chǎn)品質(zhì)量保證和控制具有較高要求。目前，飼料及飼料添加劑中多黏菌素B和E的檢測(cè)主要有微生物檢測(cè)法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]及高效液相色譜法[10](High performance liquid chromatography，HPLC)?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版[11]則采用抗生素微生物檢定法，但其操作步驟多，環(huán)境潔凈度要求較高，且測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差[12]，難以體現(xiàn)實(shí)際效價(jià)。朱曦等[13]建立了高效液相色譜/紫外檢測(cè)法(High performance liquid chromatography ultraviolet detection，HPLC/UVD)測(cè)定硫酸黏菌素多種劑型中多黏菌素E的含量，但因多黏菌素類(lèi)藥物紫外吸收較弱，需在遠(yuǎn)紫外區(qū)測(cè)定，結(jié)果易受其他雜質(zhì)影響。Kimura等[14]建立了間接熒光法分離測(cè)定多黏菌素類(lèi)藥物，但需增加衍生步驟，操作難以控制，精密度不高。因此，建立快速、靈敏、可靠的檢測(cè)方法對(duì)原料藥質(zhì)量控制具有重要意義。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Evaporative light scattering detector，ELSD)作為一種通用型檢測(cè)器，其響應(yīng)不依賴(lài)于化合物的光學(xué)特性，適用于檢測(cè)無(wú)光學(xué)吸收或吸收弱的物質(zhì)[15-16]。本文開(kāi)發(fā)了一種分別測(cè)定多黏菌素B和多黏菌素E原料藥中各自主成分含量的HPLC/ELSD分析方法，為該類(lèi)原料藥與制劑的分析和質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),配2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；AG204型精密電子分析天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

多黏菌素E對(duì)照品(含量84.7%，批號(hào):P689400，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；多黏菌素B對(duì)照品(含量92.6%，批號(hào):50410，德國(guó)Dr.Ehrenstrofer公司)；多黏菌素B原料藥1號(hào)、多黏菌素E原料藥1號(hào)和2號(hào)均購(gòu)于市場(chǎng)；甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher scientific公司);乙酸銨(色譜純，美國(guó)Tedia公司)。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取多黏菌素B和多黏菌素E對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，以0.1%甲酸水溶液稀釋至刻度，超聲、搖勻，配成1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別取0.25、0.50、1.0 mL于10 mL容量瓶中,定容，超聲，配成25、50、100 μg/mL的對(duì)照品工作液，備用。

1.4 供試品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取13.2 mg多黏菌素B(標(biāo)示含量為75.6%)和11.0 mg多黏菌素E(標(biāo)示含量為90.5%)供試品，置于10 mL容量瓶中，用初始比例流動(dòng)相稀釋至刻度，超聲處理5 min，以流動(dòng)相定容，混勻，配成1 mg/mL溶液后，按“1.3”方法稀釋配成25、50、100 μg/mL的供試品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex Biphenyl column(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為20 mmol/L乙酸銨(含0.6%甲酸)。多黏菌素B梯度洗脫程序：0～1 min，15%A；1～6 min，15%～50%A；6～9 min，50% A；9～11.5 min，50%～15% A；11.5～16.0 min，15% A。多黏菌素E梯度洗脫程序：0～1 min，15%A；1～10 min，15%～50%A；10～13 min，50% A；13～15.5 min，50%～15% A；15.5～18.0 min，15% A。流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：50 μL。ELSD參數(shù)：漂移管溫度55 ℃，載氣壓力20 psi，增益250，動(dòng)力模式為冷卻模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

目前分離多黏菌素類(lèi)藥物的色譜柱主要為C18柱[17]，實(shí)驗(yàn)考察了Phenomenex Kinetex Biphenyl(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、Waters symmetry C18(4.6 mm×250 mm i.d.，5 μm)及Elite Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm i.d.，5 μm)色譜柱對(duì)目標(biāo)藥物分離度的影響。結(jié)果顯示，2種C18色譜柱均表現(xiàn)為分析物保留差、拖尾、響應(yīng)低，而Kinetex聯(lián)苯柱較C18色譜柱有更好的保留，且其分離度高、峰窄、無(wú)拖尾。另外，采用C18色譜柱分析時(shí)，通常需要在流動(dòng)相中添加七氟丁酸等離子對(duì)試劑或添加高濃度磷酸溶液以增加分析物的保留、改善分析物峰形、提高靈敏度[18]，但這會(huì)損耗色譜柱性能從而降低其使用壽命。Biphenyl聯(lián)苯基色譜柱對(duì)各類(lèi)化合物均具有出色的保留和色譜性能，100%水相穩(wěn)定，由雙環(huán)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的高密度電子云可起到類(lèi)似弱陽(yáng)離子交換的作用，使得堿性化合物的保留增強(qiáng)，其對(duì)多黏菌素類(lèi)極性化合物顯示出高選擇性和卓越的分離能力，因此本文選擇Phenomenex Kinetex Biphenyl(50 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

采用ELSD檢測(cè)時(shí)，在選擇揮發(fā)性流動(dòng)相前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子多黏菌素類(lèi)極性化合物的有效分離和獲得高的分析靈敏度至關(guān)重要[19]。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇或乙腈為有機(jī)相，水、甲酸水或酸化乙酸銨水溶液為水相時(shí)，對(duì)目標(biāo)藥物分離度和峰形的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)僅使用典型的流動(dòng)相(如乙腈-水或甲醇-水)時(shí)，待測(cè)物的分離度和峰形均不理想；添加甲酸后，目標(biāo)物峰形改善，分離度和響應(yīng)值均有增加，但乙腈體系遜于甲醇體系。此外，流動(dòng)相使用乙酸銨緩沖溶液可減少分析物的二次保留，改善峰拖尾問(wèn)題。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-20 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.6%甲酸)為流動(dòng)相，此條件下目標(biāo)分析物峰形尖銳、分離度好、靈敏度高。

2.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件的優(yōu)化

ELSD信號(hào)響應(yīng)只與流出物中化合物的濃度相關(guān)，適用于檢測(cè)無(wú)發(fā)色基團(tuán)的藥物[20]。本文通過(guò)優(yōu)化漂移管溫度、載氣壓力及增益，以獲得最佳ELSD條件。結(jié)果表明，目標(biāo)藥物響應(yīng)隨著漂移管溫度升高而增強(qiáng)，但溫度高于55 ℃后，藥物會(huì)由于過(guò)度霧化而響應(yīng)下降，因此選擇漂移管溫度為55 ℃；載氣壓力與流動(dòng)相及化合物的揮發(fā)性有關(guān)，當(dāng)載氣壓力高于30 psi時(shí)，藥物幾乎無(wú)響應(yīng)，因此選擇最低的載氣壓力20 psi；增益為儀器響應(yīng)的放大倍數(shù)，ELSD增益增加，被測(cè)化合物的響應(yīng)值增大，但基線噪音也隨之增大，綜合考慮最終增益設(shè)定為250。在此ELSD條件下，目標(biāo)化合物均能獲得良好的響應(yīng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)在上述優(yōu)化色譜條件下，分別取同質(zhì)量濃度(100 μg/mL)的對(duì)照品溶液、供試品溶液和試劑空白溶液進(jìn)樣，獲得相應(yīng)的色譜圖(圖1)，由圖可見(jiàn)，多黏菌素B和E各主成分分離良好，在其相應(yīng)保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰。

圖2 多黏菌素B和多黏菌素E的液相色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatograms of polymyxin B and polymyxin EA.reference substance;B.the corresponding reagent blank control solution;C.sample solution

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限分別準(zhǔn)確移取多黏菌素B和多黏菌素E對(duì)照品儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相稀釋配成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下進(jìn)樣測(cè)定，多黏菌素B峰面積以B1與B2峰面積之和計(jì)，多黏菌素E峰面積以E1與E2峰面積之和計(jì)。經(jīng)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)獲得ELSD色譜圖，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，多黏菌素B和E在10～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程分別為y=0.634 5x-1.942(r=0.998 8)和y=0.568 9x-1.525(r=0.999 5)。以3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算得檢出限(LOD)分別為0.8 μg/mL和1.2 μg/mL；以S/N=10計(jì)算得定量下限(LOQ)分別為2.6 μg/mL和4.0 μg/mL。

2.4.3 精密度準(zhǔn)確吸取“1.3”配制的多黏菌素B和多黏菌素E對(duì)照品溶液(50 μg/mL)，在優(yōu)化條件下測(cè)定，同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積，以其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示儀器精密度。結(jié)果表明，多黏菌素B及多黏菌素E對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.2%和1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn)分別準(zhǔn)確移取1 mg/mL對(duì)照品溶液各0.20、0.50、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入“1.4”配制的1 mg/mL供試品溶液0.25 mL，用初始比例流動(dòng)相定容至刻度，搖勻、超聲，分別配成低、中、高3個(gè)添加濃度，每個(gè)濃度配制3份，連續(xù)測(cè)定3批次。分別計(jì)算同一批(n=3)和3批次(n=9)的平均回收率及RSD。結(jié)果顯示，多黏菌素B和多黏菌素E在3個(gè)添加濃度下的批內(nèi)回收率分別為100%～104%和101%～103%，批內(nèi)RSD分別為0.90%～2.4%和0.90%～2.6%；批間回收率分別為101%～103%和101%～102%，批間RSD分別為1.1%～1.9%和1.3%～1.7%。該方法準(zhǔn)確、可靠，完全滿(mǎn)足藥物含量分析的精密度和回收率要求。

2.4.5 穩(wěn)定性取多黏菌素B原料藥1號(hào)與多黏菌素E原料藥1號(hào)供試品溶液(50 μg/mL)，分別在0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算各待測(cè)物峰面積。結(jié)果顯示，多黏菌素B與多黏菌素E峰面積的RSD分別為0.7%與0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

取多黏菌素B-1號(hào)和多黏菌素E-1號(hào)、E-2號(hào)原料藥樣品，采用本方法在優(yōu)化條件下處理并測(cè)定；并用滅菌生理鹽水分別配制多黏菌素B和多黏菌素E供試品溶液和對(duì)照品溶液，按照《中國(guó)獸藥典》2015版和《中國(guó)獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版微生物檢定法中的比濁法測(cè)定溶液的OD(光密度)值，通過(guò)計(jì)算得到供試品藥物含量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，本方法與微生物檢定法測(cè)定結(jié)果相差不大，但本方法的RSD明顯低于微生物檢定法。

表1 高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法與微生物檢定法測(cè)定結(jié)果比較(n=3)Table 1 Comparison of the results obtained from HPLC/ELSD and microbial assay(n=3)

3 結(jié) 論

本研究首次建立了高效液相色譜/蒸發(fā)光散射法用于多黏菌素B及多黏菌素E原料藥中主成分含量的測(cè)定，該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，與傳統(tǒng)的微生物檢定法測(cè)定結(jié)果相當(dāng)，且精密度更高，可用于多黏菌素B和多黏菌素E兩種原料藥的質(zhì)量控制。