基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測紅花治療心肌缺血的作用機(jī)制▲

謝 巍 楊 妮 肖 萍 黃艷玲

(廣西柳州市婦幼保健院藥學(xué)部，柳州市 545001，電子郵箱：915007149@qq.com)

發(fā)生心肌缺血時(shí)由于心臟血液灌注量減少導(dǎo)致供氧降低，能量代謝異常，從而無法維持心臟正常的功能[1]。血壓降低、冠狀動(dòng)脈阻塞、炎癥、心瓣膜病、血黏度變化、心肌病變均會(huì)引發(fā)心肌缺血。臨床上，西醫(yī)對(duì)心肌缺血的治療重在改善供血、降低耗氧以及提高心肌組織對(duì)低氧的耐受性[2-3]。中醫(yī)將該病歸屬于“胸痹”范疇[4]，其主要病機(jī)為心脈痹阻，活血化瘀類中藥常用于心肌缺血的治療。紅花為菊科植物，性辛、溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，其主要的化學(xué)成分有黃酮類、甾體、酚酸類、雙醇、木脂素、查爾酮、炔類、揮發(fā)油等[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅花具有顯著抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善血流動(dòng)力學(xué)的作用[6-7]，其主要活性成分為紅花黃色素，能顯著減輕控制性降壓誘導(dǎo)的兔海馬缺血缺氧性損傷，可能是通過抑制神經(jīng)型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作用[8]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此紅花抗心肌缺血的機(jī)制是多方面的，但現(xiàn)階段缺乏對(duì)紅花抗心肌缺血的藥效成分及作用機(jī)制的整體認(rèn)識(shí)。 因此，探討紅花治療心肌缺血作用機(jī)制有十分重要的指導(dǎo)意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。其將疾病的治療策略由一個(gè)靶點(diǎn)、一個(gè)藥治療轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠€(gè)靶點(diǎn)、多種組分治療，與中藥治病“整體性、多靶點(diǎn)”的原則相符合。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建紅花“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析紅花中有效成分治療心肌缺血的作用機(jī)制，尋找關(guān)鍵作用分子和信號(hào)通路， 為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 紅花活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索紅花的全部化學(xué)成分，再篩選口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18[9]的有效成分。進(jìn)一步利用該平臺(tái)查詢有效成分的作用靶點(diǎn)，并將篩選出的靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化為Swiss-Prot 號(hào)和相應(yīng)的簡稱。

1.2 心肌缺血疾病相關(guān)靶基因的收集 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫平臺(tái)(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)和OMIM數(shù)據(jù)庫平臺(tái)(https://omim.org/)，檢索心肌缺血的相關(guān)靶基因。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，將獲得的基因信息標(biāo)準(zhǔn)化，刪除無人類樣本Uniprot ID的基因。

1.3 基因映射 將紅花中有效成分靶點(diǎn)和心肌缺血的相關(guān)靶基因進(jìn)行基因映射(利用XLS表格進(jìn)行基因映射對(duì)比)，從而獲取有效成分和疾病共同作用的靶基因；并用R3.5.0軟件VennDiagram包繪制維恩圖，確定共同作用的靶基因。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將紅花-心肌缺血共同作用靶點(diǎn)的基因上傳至STRING平臺(tái)(https://string db.org/) 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”(>0.4)，蛋白種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得紅花-心肌缺血的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 利用Cytoscape v3.6.0軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，將信號(hào)通路富集數(shù)量前20 位的靶點(diǎn)與該通路中的蛋白構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中與1個(gè)節(jié)點(diǎn)相互作用的數(shù)目用度值表示，參與的生物功能越多則度值越大，表明在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。

1.6 功能富集分析及通路富集分析 應(yīng)用R 3.5.0軟件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等安裝包進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO) 功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，將富集分析所預(yù)測的化學(xué)成分靶點(diǎn)(P≤0.05)進(jìn)行可視化處理，進(jìn)一步分析紅花治療心肌缺血的生物過程和信號(hào)通路，最終分別繪制 GO功能富集分析的條形圖和 KEGG 富集分析的氣泡圖和通路分析圖。

2 結(jié) 果

2.1 紅花的藥效成分及其作用靶點(diǎn) 共收集到紅花活性化合物189個(gè)，篩選出OB≥30%和DL≥0.18的高活性化合物共22 個(gè)， 分別對(duì)應(yīng)得到化合物的作用靶點(diǎn)共1 466個(gè)。以自由度值表示預(yù)測出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，自由度值的大小即代表著在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)度，根據(jù)活性成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度(設(shè)定度值為>1)進(jìn)一步篩選。因在數(shù)據(jù)庫中6個(gè)活性成分無作用靶點(diǎn)，最終篩選出 218個(gè)作用靶點(diǎn)。槲皮素(自由度=77)的作用靶點(diǎn)最多，其次為山柰酚(自由度=34)和木樨草素(自由度=28) 。在22個(gè)活性成分中有13個(gè)成分有2個(gè)或以上的靶點(diǎn)。見表1。

表1 紅花 中22個(gè)高活性化合物

2.2 “紅花-心肌缺血”共同靶點(diǎn)的篩選 共獲得531個(gè)心肌缺血疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將這531個(gè)疾病靶點(diǎn)與218個(gè)紅花化學(xué)成分作用靶點(diǎn)相交集，獲得紅花-心肌缺血共同靶點(diǎn)39個(gè)，見圖1。

圖1 心肌缺血疾病相關(guān)靶點(diǎn)與紅花有效成分作用靶點(diǎn)的維恩圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將39個(gè)紅花-心肌缺血共同靶點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型(見圖2)；結(jié)果顯示，紅花的13種藥效成分協(xié)同作用于39個(gè)心肌缺血靶點(diǎn)，其中與槲皮素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)達(dá)31個(gè)，與山柰酚對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有13個(gè)，說明槲皮素可能起到潛在關(guān)鍵作用。每個(gè)靶點(diǎn)均有2個(gè)以上的成分協(xié)同作用，其中，8種潛在藥效成分共同作用于過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)基因，10種潛在藥效成分共同作用于前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)基因。

圖2 “活性成分-作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病”網(wǎng)絡(luò)模型

注：三角形代表中藥紅花，菱形代表靶點(diǎn)，黃色橢圓形代表成分，紅色橢圓形代表心肌缺血疾病。

2.4 PPI分析 將39個(gè)紅花-心肌缺點(diǎn)共同靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包括39個(gè)節(jié)點(diǎn)，292條連線；每一條連線表示有一種證據(jù)證明兩個(gè)蛋白有互作關(guān)系；每一個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)的顏色表示不同的連接證據(jù)；節(jié)點(diǎn)自由度的大小表示其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。在此基礎(chǔ)上篩選出30個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(篩選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)節(jié)點(diǎn)之間的連線多少進(jìn)行篩選，篩選連線較多的30個(gè)節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn))，并繪制關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)的條形圖；自由度較高的節(jié)點(diǎn)依次為白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、白蛋白(albumin,ALB)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、體細(xì)胞細(xì)胞色素C(cytochrome c,somatic,CYCS)、MYC、NOS3、PPARG、Fos。見圖3、圖4。

圖3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)條形圖

2.5 GO 功能富集分析 對(duì)紅花-心肌缺血的39個(gè)共同作用靶蛋白進(jìn)行GO生物功能分析，確定對(duì)應(yīng)的條目(P<0.05)， 繪制排名前20位的GO 條目，如圖5所示，圖中顏色越紅，表明功能富集越密集。共同作用靶點(diǎn)主要富集在激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、核激素受體結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性等48個(gè)生物過程。這表明紅花可通過調(diào)控激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及雌激素受體結(jié)合等方面治療心肌缺血。見圖5。

圖5 GO功能富集分析條形圖

2.6 KEGG通路分析 對(duì)紅花-心肌缺血的39個(gè)共同作用靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，繪制排名前20位的KEGG氣泡圖(P≤0.05)，同時(shí)對(duì)篩選的核心通路加以注釋。氣泡圖中顏色與大小取決于關(guān)聯(lián)基因Count值和P值，紅色節(jié)點(diǎn)越大信號(hào)通路的顯著性就越高，說明該條信號(hào)通路的重要性越高。共同靶點(diǎn)主要富集于心肌缺血相關(guān)信號(hào)流體切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥的年齡憤怒信號(hào)、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、乙型肝炎、南美錐蟲病、人巨細(xì)胞病毒感染等114個(gè)通路，這提示紅花通過作用于多條通路來治療心肌缺血，且這些通路間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。見圖6。

其中，IL-17通路由6個(gè)成員IL-17A～F組成，而IL-17受體家族由5個(gè)成員IL-17受體A～E組成。IL-17通路在自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制和癌癥方面有重要的意義，因此以IL-17通路為例繪制KEGG通路分析圖。由通路圖可知，使用紅花治療心肌缺血，可通過影響IKKa蛋白、IkBa蛋白、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2、凋亡信號(hào)分子(Caspase-3)轉(zhuǎn)錄激活A(yù)P-1因子，進(jìn)一步影響CCL2、趨化因子(C-X-C基序)配體[chemokine(C-X-C motif)ligand，CXCL1]1、CXCL12趨化因子、IL-6、Fos等因子的表達(dá)，從而調(diào)控IL-17通路。見圖6、圖7。

圖6 KEGG通路富集氣泡

注：X軸表示關(guān)聯(lián)基因數(shù)占信號(hào)通路上總基因數(shù)的比例，Y軸表示通路名稱。

圖7 IL-17通路分析圖

3 討 論

心肌缺血是心臟供氧減少、心肌能量代謝不正常導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌缺血是由于血壓降低、主動(dòng)脈供血減少或者冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的心臟供血減少，此外心瓣膜病、血黏度變化、心肌本身病變也會(huì)導(dǎo)致心肌缺血[10]。雖然目前對(duì)心肌缺血的認(rèn)識(shí)不斷增加，但藥物治療心肌缺血的作用機(jī)制尚不完全明確，故基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測紅花單味中藥在治療心肌缺血中的作用機(jī)制和關(guān)鍵通路有重要意義。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法出發(fā)，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)收集了紅花中22種活性高化合物和1 446個(gè)靶點(diǎn)。另一方面，采用GeneCards數(shù)據(jù)平臺(tái)和OMIM數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)平臺(tái)檢索得到531個(gè)心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)，并將兩者進(jìn)行基因映射，獲得 39個(gè)共同基因靶點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。 通過網(wǎng)絡(luò)分析獲得木酚素、6-羥基甲醇、黃芩素、槲皮素等13種藥效成分，發(fā)現(xiàn)其協(xié)同作用于ESR1、PTGS1、PPARG、VEGFA、BCL2等39個(gè)心肌缺血靶點(diǎn)，這充分體現(xiàn)了中藥“多疾病”“多成分”“多靶點(diǎn)”的理論基礎(chǔ)。在“活性成分-作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病”網(wǎng)絡(luò)模型中可以看出，槲皮素對(duì)應(yīng)的心肌缺血靶點(diǎn)最多，說明紅花中槲皮素在治療心肌缺血方面可能起到了關(guān)鍵作用。而現(xiàn)代藥理研究也表明，槲皮素及其代謝物具有顯著抗氧化、抗炎作用[11]，并且能調(diào)控心房鈉尿肽對(duì)心血管疾病產(chǎn)生影響[12]。進(jìn)一步行GO功能富集分析 顯示，紅花治療心肌缺血的基因功能主要體現(xiàn)在雌激素受體結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等方面；KEGG通路富集分析顯示紅花治療肺癌可能的信號(hào)通路為波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥的年齡憤怒信號(hào)、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索紅花治療心肌缺血潛在的關(guān)鍵靶基因及信號(hào)通路，或可為紅花的后續(xù)研發(fā)提供新的思路與方法。但本研究所得的結(jié)果仍存在不足之處，因此，在后期研究中還需臨床試驗(yàn)證實(shí)通過數(shù)據(jù)挖掘預(yù)測得到的藥物作用和功能。其次，本研究在篩選OB和DL時(shí)也存在一些限制，僅選取了口服的藥物。而目前隨著藥物的制劑研發(fā)飛速發(fā)展，紅花提取物的注射劑已被廣泛應(yīng)用于臨床。此外，在后期的新藥預(yù)測和研發(fā)中，口服利用度較低的成分也需要引起我們的重視，可能潛在有更廣泛的治療作用[13]。