超高效液相色譜法測(cè)定兒童指畫印泥中柚皮苷和苯甲酸地那銨

望秀麗，衛(wèi)碧文，高 歡，于文佳

(上海海關(guān)機(jī)電產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)中心，上海200135)

苦味劑又稱厭惡劑、阻食劑，是一種添加于產(chǎn)品中，使其味道或氣味帶有苦味以防止人們尤其是兒童吸入或攝入的有毒有害物質(zhì)，以及防止嚙齒類和鳥類破壞設(shè)施而廣泛使用的化學(xué)制劑[1]。苯甲酸地那銨，也稱苦精，其結(jié)構(gòu)由苯甲酸基團(tuán)和地那銨基團(tuán)組成，是目前已知的最苦的化合物，是苦味劑的典型代表。苯甲酸地那銨具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、易于獲得、極易溶于水等特點(diǎn)。苯甲酸地那銨的哺乳動(dòng)物半數(shù)致死量為841 mg·kg－1(體重)，僅需極少量(0.000 01%)添加即可起到阻食效果[2]，其在通常使用條件下安全無毒，是日常消費(fèi)品中常用的苦味劑，例如為防止兒童攝入有毒但帶有甜的防凍劑，可在其中加入苯甲酸地那銨。柚皮苷是從西柚皮中分離的一種雙氫黃酮類化合物，有苦味。柚皮苷作為苦味劑，具有可以食用、安全無毒、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。為了盡可能降低幼兒潛在的有意或無意將指畫顏料放入口中的風(fēng)險(xiǎn)，世界多標(biāo)準(zhǔn)均要求指畫顏料中應(yīng)添加的苦味劑為柚皮苷和苯甲酸地那銨。歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN 71-7:2014＋A2:2018、國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 8124-7:2015 和國家指畫顏料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn) GB 6675.14－2014 對(duì)苦味劑的要求是一致的。上述標(biāo)準(zhǔn)給出了參考添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:1%柚皮苷、0.000 4%(4 mg·kg－1)苯甲酸地那銨。

目前，國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的苯甲酸地那銨的儀器分析方法主要為高效液相色譜法[3-5]，柚皮苷的儀器分析方法主要為高效液相色譜法[6]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]。國內(nèi)和國際上有關(guān)消費(fèi)品中的涉及柚皮苷和苯甲酸地那銨的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)包括ASTM D7304－2014和EN 1214:1997。國內(nèi)外涉及苯甲酸地那銨的測(cè)定方法的文獻(xiàn)數(shù)量較少，文獻(xiàn)[3]報(bào)道了高效液相色譜法測(cè)定俄勒岡消費(fèi)品中苯甲酸地那銨的方法，將樣品用甲醇稀釋，離心，過濾后，采用高效液相色譜法測(cè)定，測(cè)定下限為1.25 mg·L－1。國內(nèi)外涉及柚皮苷的測(cè)定方法的文獻(xiàn)主要集中在中藥方面[6-7，9]，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方當(dāng)歸膠囊、通宣理肺顆粒、衢枳殼和去滯散中柚皮苷的方法。文獻(xiàn)[7]報(bào)道了高效液相色譜法(二極管陣列檢測(cè)器)和高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定參術(shù)健脾湯中14種生物活性化合物的方法。

兒童指畫印泥為指畫顏料的一種，兒童用手指在兒童指畫印泥上蘸取顏料進(jìn)行創(chuàng)作，兒童意識(shí)薄弱，若兒童指畫印泥產(chǎn)品無添加苦味劑或添加量不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，兒童易通過舔食對(duì)其身心健康造成嚴(yán)重危害。超高效液相色譜法具有分析速率快、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，目前，尚未見超高效液相色譜法測(cè)定兒童指畫印泥中柚皮苷和苯甲酸地那銨的報(bào)道。本工作采用超高效液相色譜法測(cè)定兒童指畫印泥中柚皮苷和苯甲酸地那銨的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC 型超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器；eppendorf 5810 R 型離心機(jī)；Elma P180H 型超聲儀；0.22μm 有機(jī)系過濾膜。

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1，稱取100 mg柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，用適量甲醇溶解后，用甲醇定容至100.0 m L。

苯甲酸地那銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1，稱取100 mg苯甲酸地那銨標(biāo)準(zhǔn)品，用適量水溶解后，用水定容至100.0 m L。

甲醇、乙腈均為色譜純；柚皮苷的純度不小于97%，苯甲酸地那銨的純度不小于95%；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)，柱溫40 ℃；流量0.3 m L·min－1；進(jìn)樣量10μL。流動(dòng)相:A 為乙腈，B為p H 4.3的0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液。梯度洗脫程序:0～2.0 min 時(shí)，A 由10%升至30%，保持3.0 min；5.0～5.1 min時(shí)，A 由30%降至10%，保持1.9 min。柚皮苷測(cè)定波長為282 nm，苯甲酸離子測(cè)定波長為230 nm，地那銨離子測(cè)定波長為210 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取約0.2 g兒童指畫印泥樣品于具塞錐形瓶中，加入甲醇與0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液以體積比3∶7組成的混合液(萃取溶劑)10 m L，振蕩1 min使樣品充分浸潤，超聲萃取20 min，冷卻至室溫，于16 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液過0.22μm 過濾膜過濾后，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

2.1.1 測(cè)定波長

按儀器工作條件采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)掃描柚皮苷和苯甲酸地那銨的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，柚皮苷、苯甲酸離子和地那銨離子的紫外吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra

由圖1 可知:柚皮苷的最大吸收波長為282 nm，苯甲酸離子的最大吸收波長為230 nm，地那銨離子的最大吸收波長在210 nm 附近，但在波長210 nm 附近有紫外吸收的物質(zhì)較多，易產(chǎn)生干擾，波長282 nm 處其余目標(biāo)物的靈敏度太低。試驗(yàn)選擇不同測(cè)定波長進(jìn)行定性和定量，試驗(yàn)選擇的測(cè)定波長見1.2節(jié)。

2.1.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)考察了甲醇-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-乙酸銨溶液等3種流動(dòng)相的洗脫效果。結(jié)果表明:上述3種流動(dòng)相對(duì)柚皮苷和地那銨離子保留時(shí)間的影響較??；乙腈-磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相時(shí)，柚皮苷和地那銨離子的響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)于甲醇-磷酸二氫鉀溶液和乙腈-乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)柚皮苷和地那銨離子的響應(yīng)強(qiáng)度；使用甲醇-磷酸二氫鉀溶液和乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相洗脫時(shí)，無苯甲酸離子色譜峰出現(xiàn)。綜合考慮，試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鉀溶液。

流動(dòng)相的酸度對(duì)柚皮苷、苯甲酸離子和地那銨離子的色譜行為有影響，因此通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸度以達(dá)到更好的分離。根據(jù)色譜柱適用的p H 范圍(1～12)和苯甲酸地那銨的p Ka(4.05)，結(jié)合文獻(xiàn)使用流動(dòng)相磷酸二氫鉀溶液的p H，固定柚皮苷和苯甲酸地那銨的質(zhì)量濃度為10.0 mg·L－1，按儀器工作條件進(jìn)行梯度洗脫，考察了流動(dòng)相p H 分別為3.0，4.3，4.6，6.0時(shí)對(duì)柚皮苷、苯甲酸離子和地那銨離子分離的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知:流動(dòng)相p H 為3.0時(shí)，苯甲酸離子未出峰；流動(dòng)相p H 為4.3及以上時(shí)，苯甲酸離子出峰。推測(cè)產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因:苯甲酸離子色譜行為的變化與其p Ka相關(guān)。在強(qiáng)酸性條件下，苯甲酸離子被質(zhì)子化，在波長200 nm 以上均沒有吸收。苯甲酸地那銨的p Ka為4.05，在流動(dòng)相p H 為4.3及以上時(shí)，苯甲酸地那銨主要以離子狀態(tài)存在，隨著p H 的逐漸增大，離子型的含量增多，峰面積增大，極性增強(qiáng)，與反相色譜柱的保留能力減弱，保留時(shí)間減小。在流動(dòng)相p H 大于4.3時(shí)，柚皮苷和地那銨離子的色譜峰隨著流動(dòng)相p H 增大，峰高降低，峰形變寬，對(duì)稱性變差。綜合考慮靈敏度、重現(xiàn)性和色譜峰的對(duì)稱性，試驗(yàn)選擇流動(dòng)相p H 為4.3，用地那銨離子來定性和定量苯甲酸地那銨。

圖2 流動(dòng)相酸度對(duì)柚皮苷、苯甲酸離子和地那銨離子分離的影響Fig.2 Effect of acidity of mobile phase on separation of naringin，benzoate and denatonium

2.1.3 流動(dòng)相流量

試驗(yàn)考察了流動(dòng)相流量分別為0.2，0.3，0.4，0.5 m L·min－1時(shí)對(duì)柚皮苷和地那銨離子分離的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知:當(dāng)流動(dòng)相流量從0.2 m L·min－1提高至0.5 m L·min－1時(shí)，柚皮苷和地那銨離子的分析時(shí)間由6.3 min減少至3.2 min，同時(shí)地那銨離子色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。綜合考慮分析效率和色譜峰的對(duì)稱性，試驗(yàn)選擇流動(dòng)相流量為0.3 m L·min－1。

圖3 流動(dòng)相流量對(duì)柚皮苷和地那銨離子分離的影響Fig.3 Effect of flow rate of mobile phase on separation of naringin and denatonium

2.1.4 色譜柱柱溫

試驗(yàn)考察了色譜柱柱溫分別為30，35，40 ℃時(shí)對(duì)柚皮苷和地那銨離子分離的影響。結(jié)果表明:隨著色譜柱柱溫從30 ℃升至40 ℃，柚皮苷和地那銨離子的分析時(shí)間有所減少，并且在色譜柱柱溫為40 ℃時(shí)，地那銨離子的色譜峰形尖且對(duì)稱性好?？紤]到分析效率和色譜柱的耐受性，試驗(yàn)選擇色譜柱柱溫為40 ℃。

2.2 萃取溶劑

試驗(yàn)考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)依次為10%，20%，30%的甲醇-0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液為萃取溶劑時(shí)對(duì)柚皮苷和苯甲酸地那銨回收率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知:萃取溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)從10%增加至30%時(shí)，柚皮苷的回收率從25.0%提高至93.2%，苯甲酸地那銨的回收率在99.7%～101%之間；隨著萃取溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，柚皮苷的回收率顯著增加，苯甲酸地那銨的回收率保持穩(wěn)定。綜合考慮萃取效率和流動(dòng)相的洗脫能力，試驗(yàn)選擇萃取溶劑為甲醇與0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液以體積比3∶7組成的混合液。

圖4 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷和苯甲酸地那銨回收率的影響Fig.4 Effect of volume fraction of methanol on recovery of naringin and denatonium benzoate

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按儀 器 工 作 條 件 對(duì)0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mg·L－1柚皮苷和苯甲酸地那銨的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:柚皮苷和苯甲酸地那銨的質(zhì)量濃度均在0.1～5.0 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

以未檢出柚皮苷和苯甲酸地那銨的兒童指畫印泥樣品作為空白樣品，按照試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知:回收率為73.5%～104%，RSD 為4.2%～6.6%，能夠滿足定量分析的要求。

2.5 樣品分析

按儀器工作條件測(cè)定了網(wǎng)購所得的10種兒童指畫印泥樣品中的柚皮苷和苯甲酸地那銨，柚皮苷和苯甲酸地那銨均未檢出，不符合國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 6675.14－2014《玩具安全 第14部分:指畫顏料技術(shù)要求及測(cè)試方法》的要求。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是雖然國內(nèi)外指畫顏料標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制要求添加苦味劑以避免兒童誤食，但是并無相應(yīng)測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。

本工作建立了超高效液相色譜法測(cè)定兒童指畫印泥中柚皮苷和苯甲酸地那銨的分析方法。本方法快速簡便，其線性范圍、回收率、檢出限、精密度均能滿足EN 71-7:2014＋A2:2018、ISO 8124－7:2015和GB 6675.14－2014對(duì)苦味劑的限制要求。本方法的建立能為相關(guān)管理部門的監(jiān)管提供測(cè)定依據(jù)，以促使生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，保護(hù)我國未成年人的合法權(quán)益。